פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.
אנטרוקוליטיס נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית המשפיעה על פגים, המאופיינת בדלקת מעיים ונמק. אנטרואידים התגלו לאחרונה כמערכת מבטיחה למודל פתולוגיות במערכת העיכול. עם זאת, השיטות המשמשות כיום למניפולציה אנטרואידית חסרות גישה לפני השטח האפיקליים של האפיתל (תלת-ממדי [3D]) או שהן גוזלות זמן ועתירות משאבים (מונולרים דו-ממדיים [2D]). שיטות אלה דורשות לעתים קרובות שלבים נוספים, כגון מיקרו-הזרקה, כדי שהמודל יהפוך לניתן לתרגום פיזיולוגי. כאן אנו מתארים פרוטוקול רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וזול לחקר NEC במבחנה על ידי היפוך קוטביות אנטרואידית, וכתוצאה מכך המשטח האפיקלי פונה כלפי חוץ (apical-out). כמו כן מסופק פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לבחינת שלמות מחסום אנטרואידי וביטוי חלבונים צומתי לאחר חשיפה לגורם נמק גידולי – אלפא (TNF-α) או ליפופוליסכריד (LPS) בתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. כמו כן, נבדקת הכדאיות של אנטרוידים אפיקליים תלת-ממדיים החשופים ל-LPS נורמוקסי או היפוקסי או ל-TNF-α במשך 24 שעות. אנטרוידים שנחשפו ל-LPS או ל-TNF-α, בשילוב עם היפוקסיה, הפגינו הפרעה בארכיטקטורת האפיתל, אובדן ביטוי של חלבון צומת הדבקות וירידה בכדאיות התא. פרוטוקול זה מתאר מודל חדש של NEC-in-a-dish המציג פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית וחסכונית לזיהוי מטרות אפיתל פוטנציאליות לטיפולי NEC ולחקר תגובת המעיים המוקדמת לטיפולים.
דלקת המעי הגס (NEC), מחלה דלקתית חמורה של המעי הדק המתרחשת בעד 10% מהפגים, קשורה בדרך כלל לתחלואה גבוהה ולתמותה 1,2. שיעורי תמותה המתקרבים ל-50% בתינוקות במשקל לידה נמוך מאוד (<1500 גרם), הדורשים התערבות כירורגית, אינם נדירים3. בעוד שהאטיולוגיה המדויקת של NEC אינה מובנת כיום, גורמי סיכון, כגון הזנת פורמולה, נחשבים למורכבים עם אנומליות פיזיולוגיות, כגון דיסביוזיס, אפיתל מעיים לא בשל, ומחסום מעיים לא מתפקד, בהתפתחות המחלה 2,4. למרות מאמץ משמעותי, התקדמות מועטה במניעה או בטיפול ב- NEC התרחשה בעשורהאחרון 5. שיטה חדשנית במבחנה לחקר NEC ותפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים נדרשת כדי לקדם את ההבנה של הפתוגנזה של המחלה, כפי שממצאים ממודלים של בעלי חיים תרגמו עד כה בצורה גרועה למיטה6.
מספר מודלים של מבחנה שימשו כדי לחקור את המנגנונים הפועלים במהלך NEC. קו תאי האפיתל במעיים האנושיים, Caco-2, הוא בין המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במבחנה של NEC 7,8. תאי Caco-2 מחקים תכונות מורפולוגיות של גבול המברשת של המעי הדק, אך כקו תאים, אינם מתמיינים למגוון הרחב של סוגי תאי in vivo, כולל תאי גביע המייצרים ריר, הנדרשים למודל הניתן לתרגום גבוה. HT-29-MTX, תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי, כוללים פנוטיפ מעורב של אנטרוציטים ותאי גביע, אך עדיין חסרים סוגי תאים מבוססי קריפטה של אפיתל המעי9. IEC-6 ו-IEC-18 הם קווי תאים שאינם מותמרים עם מורפולוגיה לא בשלה דמוית קריפטה, אך אינם נגזרים מרקמה אנושית, מה שמגביל את יכולת התרגום שלהם. קווי תאי המעי FHs 74-Int ו-H4 מופקים מרקמת עובר אנושית ואינם יוצרים צמתים הדוקים או מונולרים מקוטבים10,11, ולכן הם לא בשלים בהשוואה אפילו לפגים ביותר הרגישים ל-NEC. בדרך כלל, מודלים של NEC במבחנה משתמשים בטיפולי ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), קולטן מרכזי הגורם לדלקת מעיים ב-NEC12. נזק המתווך באמצעות טיפול במיני חמצן תגובתי (ROS), בדרך כלל באמצעות מי חמצן, משמש לעתים קרובות כדי לגרום לנזק חמצוני דמוי NEC ואפופטוזיס13,14. כגורם העיקרי לדלקת מעיים, גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α), מרכיב במורד הזרם של איתות TLR4 דלקתי, משמש בדרך כלל גם במודלים אלה במבחנה כדי לחקות פתוגנזה in vivo 15.
אורגנואידים, המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs), צברו פופולריות כמודל חוץ גופי של המעי בשל יכולתם לשחזר את ארכיטקטורת ה-in vivo המורכבת ואת הרכב התאים של הרקמה שממנה הם נגזרים16,17. מערכת חוץ גופית קשורה, אנטרואידים, הם אורגנואידים שמקורם בקריפטות מעיים שנכרתו שקל יותר להקים ולתחזק מאשר אורגנואידים שמקורם ב-iPSC. אנטרוידים גדלים בדרך כלל במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (3D) (ECM) עם גישה ניסיונית המוגבלת לפני השטח של התא הבזולטרלי. שיטות כגון מיקרו-הזרקה18,19, פותחו כדי להתגבר על מחסום זה בפני השטח האפיקלי, אך הצטברות של פסולת תאית מרופטת וליחה בתוך הלומן הופכת את המיקרו-הזרקה לקשה מבחינה טכנית ולא עקבית. מכיוון שפלטפורמות מיקרו-הזרקה רובוטיות מותאמות אישית אינן נגישות באופן נרחב20, השתנות מעבדה למעבדה ביכולת הטכנית ובטכניקה הכללית הופכת למשתנים משמעותיים שיש להתגבר עליהם באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה. מונו-שכבות דו-ממדיות (2D) שמקורן באנטרוידים תלת-ממדיים מנותקים, שעדיין כוללים את כל סוגי התאים העיקריים של אפיתל המעי, מאפשרות גישה לפני השטח האפיקליים, אך באופן מסורתי היה קשה לתחזק אותן ללא שכבת הזנה של מיופיברובלסטים מזנכימליים21. בעוד שניתן להשתמש בתמיכות חדירות של תרביות תאים כדי לגשת הן לצד האפיקלי והן לצד הבזולטרלי של מונולרים אנטרואידים ללא שימוש במיופיברובלסטים בסיסיים, תוספות אלה דורשות כריתה והרכבה של הממברנה לפני השימוש בשיטות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, וכתוצאה מכך תהליך תובעני וקשה יותר מבחינה טכנית בעת שימוש בשיטות מיקרוסקופיה מסורתיות22. NEC עוצב במבחנה באמצעות אנטרואידים תלת-ממדיים מסורתיים 23,24,25 ותומך חדירב-26,27, ודלקת מעיים שוכפלה לאחרונה עם מודלים של מעיים על שבב 28,29. בעוד שמודלים של בטן על שבב המשלבים מיקרופלואידיקה הם, ללא ספק, המודלים המתקדמים ביותר הניתנים לתרגום, טכנולוגיה זו יקרה, מורכבת ובלתי נגישה לרוב החוקרים30.
ההתקדמות האחרונה בטכניקות אנטרואידיות אפיקליות אפשרה גישה קלה יותר למשטח האפיקלי של אנטרוידים תלת-ממדיים מבלי להסתכן בפגיעה בשלמות המבנית של האפיתל במבחנה 31,32,33. אנטרוידים Apical-out חולקים את הרכב סוג התא ואת תפקוד המחסום של אפיתל מעיים in vivo, אך בניגוד לאנטרוידים תלת-ממדיים טיפוסיים, המשטחים האפיקליים של תאים אלה פונים למדיום התרבית, מה שמאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית על ספיגת חומרים מזינים, זיהום מיקרוביאלי והפרשה לומינלית31. יתרון נוסף של אנטרואידים אפיקליים הוא היכולת להפיץ באופן הומוגני חומרים ניסיוניים לאנטרואידים. נפחי טיפול משתנים המבוססים על גודל אנטרואיד אינם נדרשים, כפי שהם עם מיקרו הזרקה, והיכולת לשמור על אנטרוידים אלה בתרבית השעיה שוללת כל הפרעה ECM על דיפוזיה של סוכן ניסיוני32.
דלקת אנטרוקוליטיס נמקית היא מחלה רב-גורמית המערבת מספר סוגי תאי אפיתל מעיים ומגוון גורמים סביבתיים ופתופיזיולוגיים34. הרכב התאים המגוון של אנטרואידים במעיים הוא שיפור ברור לעומת מונוקולטורים במידול מחלה מורכבת כגון NEC. באופן מעניין, בעוד שחשיפה דלקתית אחת מספיקה לעתים קרובות כדי לגרום נזק במונוקולטורות חוץ גופיות , נראה כי אנטרואידים, כמו במודלים של עכברים23, דורשים מינימום של שני מרכיבים דלקתיים כדי לגרום לנזק דמוי NEC6. כאן, אנו מציגים מודל NEC-in-a-dish apical-out, המשתמש באנטרוואידים אפיקליים בשילוב עם היפוקסיה (תכונה קלינית חשובה של NEC6) ו- LPS או TNF-α, כמודל משופר ורלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במבחנה כדי לחקור תגובות אפיתל לדלקת דמוית NEC, ואולי גם לזהות מטרות טיפוליות. אנו מתארים פרוטוקול להיפוך הקוטביות של אנטרואידים תלת-ממדיים במעי הדק, כמו גם פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה במחסום האפיתל ושינויים בביטוי חלבונים צומתיים. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר בדיקת כדאיות אנטרואידית פשוטה כדי לקבוע את ההשפעה של מודל ה-NEC-in-a-dish שלנו, בעל שתי הלהיטים והאפיקליות.
הפיתוח האחרון של מודלים אנטרואידיים הנגזרים מקריפטות אפיתל מעיים מאפשר רקמה חוץ-גופית רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שבה ניתן לחקור פתוגנזה אנטרוקוליטיס נמקית. למרות הכללת כל סוגי התאים הממוינים העיקריים של אפיתל המעי, אנטרואידים תלת-ממדיים עדיין כפופים למספר מגבלות משמעותיות. ה?…
The authors have nothing to disclose.
תוכן זה הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. HC נתמך על ידי מענק P20GM134973 מהמכונים הלאומיים לבריאות. KB נתמך על ידי מענק של קרן בית החולים לילדים (CHF) וקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF). אנו מודים למעבדה לביולוגיה מולקולרית ומחקר ציטומטריה ב- OUHSC על השימוש במתקן הליבה, שסיפק הדמיה קונפוקלית.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
ImageJ | Fiji | N/A | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |