In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis
Summary
Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.
Abstract
Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende ziekte die premature baby’s treft, gekenmerkt door darmontsteking en necrose. Enteroïden zijn onlangs naar voren gekomen als een veelbelovend systeem om gastro-intestinale pathologieën te modelleren. Momenteel gebruikte methoden voor enteroïde manipulatie hebben echter geen toegang tot het apicale oppervlak van het epitheel (driedimensionaal [3D]) of zijn tijdrovend en resource-intensief (tweedimensionale [2D] monolagen). Deze methoden vereisen vaak extra stappen, zoals micro-injectie, om het model fysiologisch vertaalbaar te maken. Hier beschrijven we een fysiologisch relevant en goedkoop protocol voor het bestuderen van NEC in vitro door enteroïde polariteit om te keren, wat resulteert in het apicale oppervlak naar buiten gericht (apiical-out). Een immunofluorescentiekleuringsprotocol om de integriteit van de enteroïde barrière en junctionele eiwitexpressie na blootstelling aan tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) of lipopolysaccharide (LPS) onder normoxische of hypoxische omstandigheden te onderzoeken, wordt ook verstrekt. De levensvatbaarheid van 3D apiical-out enteroïden blootgesteld aan normoxische of hypoxische LPS of TNF-α gedurende 24 uur wordt ook geëvalueerd. Enteroïden blootgesteld aan LPS of TNF-α vertoonden, in combinatie met hypoxie, verstoring van de epitheliale architectuur, een verlies van adherens junction eiwitexpressie en een vermindering van de levensvatbaarheid van cellen. Dit protocol beschrijft een nieuw apicale NEC-in-een-schotelmodel dat een fysiologisch relevant en kosteneffectief platform presenteert om potentiële epitheliale doelen voor NEC-therapieën te identificeren en de premature intestinale respons op therapeutica te bestuderen.
Introduction
Necrotiserende enterocolitis (NEC), een ernstige ontstekingsziekte van de dunne darm die voorkomt bij maximaal 10% van de te vroeg geboren baby’s, wordt vaak geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2. Sterftecijfers van bijna 50% bij baby’s met een zeer laag geboortegewicht (<1500 g), die chirurgische ingrepen vereisen, zijn niet ongewoon3. Hoewel de exacte etiologie van NEC momenteel niet wordt begrepen, wordt gedacht dat risicofactoren, zoals kunstvoeding, zich vermengen met fysiologische anomalieën, zoals dysbiose, een onrijp darmepitheel en een disfunctionele darmbarrière, bij de ontwikkeling van de ziekte 2,4. Ondanks aanzienlijke inspanningen is er de afgelopen tien jaar weinig vooruitgang geboekt in de preventie of behandeling van NEC5. Een nieuwe in vitro methode om NEC en geassocieerde intestinale epitheliale barrièredisfunctie te bestuderen, is vereist om het begrip van de pathogenese van de ziekte te bevorderen, omdat bevindingen van diermodellen tot nu toe slecht zijn vertaald naar het bed6.
Een aantal in vitro modellen zijn gebruikt om de mechanismen die spelen tijdens NEC te onderzoeken. De menselijke intestinale epitheelcellijn, Caco-2, is een van de meest gebruikte in vitro modellen van NEC 7,8. Caco-2-cellen emuleren morfologische kenmerken van de dunne darm, maar differentiëren als cellijn niet in de grote verscheidenheid aan in vivo celtypen, waaronder slijmproducerende bokaalcellen, die nodig zijn voor een zeer vertaalbaar model. HT-29-MTX, menselijke colon adenocarcinoom cellen, omvatten een gemengd enterocyten- en bokaalcelfenotype, maar missen nog steeds op crypten gebaseerde celtypen van het darmepitheel9. IEC-6 en IEC-18 zijn niet-getransformeerde cellijnen met een onrijpe ileale crypte-achtige morfologie, maar zijn niet afgeleid van menselijk weefsel, waardoor hun translationele capaciteit wordt beperkt. FHs 74-Int en H4 darmcellijnen zijn afgeleid van menselijk foetaal weefsel en vormen geen tight junctions of gepolariseerde monolagen 10,11, en zijn dus onvolgroeid in vergelijking met zelfs de meest premature baby’s die vatbaar zijn voor NEC. Meestal gebruiken NEC in vitro modellen lipopolysaccharide (LPS) behandelingen om toll-like receptor 4 (TLR4) te induceren, een belangrijke receptor die darmontsteking in NEC12 initieert. Schade gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS) behandeling, meestal via waterstofperoxide, wordt vaak gebruikt om NEC-achtige oxidatieve schade en apoptose 13,14 te induceren. Als de belangrijkste aanjager van darmontsteking wordt tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), een stroomafwaartse component van de inflammatoire TLR4-signalering, ook vaak gebruikt in deze in vitro modellen om in vivo pathogenese na te bootsen15.
Organoïden, gegenereerd uit induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC’s), zijn in populariteit gegroeid als een in vitro model van de darm vanwege hun vermogen om de complexe in vivo architectuur en celachtige samenstelling van het weefsel waaruit ze zijn afgeleid te recapituleren16,17. Een verwant in vitro systeem, enteroïden, zijn organoïden afgeleid van gereseceerde darmcrypten die gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en onderhouden dan van iPSC afgeleide organoïden. Enteroïden worden meestal gekweekt in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix (ECM) met experimentele toegang beperkt tot het basolaterale celoppervlak. Methoden, zoals micro-injectie18,19, zijn ontwikkeld om deze barrière naar het apicale oppervlak te overwinnen, maar de opbouw van afgesleten cellulair puin en slijm in het lumen maakt micro-injectie zowel technisch moeilijk als inconsistent. Aangezien aangepaste robotische micro-injectieplatforms niet breed toegankelijk zijn20, worden lab-to-lab variabiliteit in technische vaardigheden en algemene techniek belangrijke variabelen die moeten worden overwonnen met micro-injectieprotocollen. Tweedimensionale (2D) monolagen afgeleid van gedissocieerde 3D-enteroïden, die nog steeds alle belangrijke celtypen van het darmepitheel omvatten, bieden toegang tot het apicale oppervlak, maar zijn traditioneel moeilijk te onderhouden zonder een feederlaag van mesenchymale myofibroblasten21. Hoewel celkweekdoorlatende steunen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen tot zowel de apicale als de basolaterale zijden van enteroïde monolagen zonder het gebruik van onderliggende myofibroblasten, vereisen deze inserts excisie en montage van het membraan voor gebruik met modaliteiten zoals confocale microscopie, wat resulteert in een technisch veeleisender en moeilijker proces bij gebruik van traditionele microscopiemethoden22. NEC is in vitro gemodelleerd met behulp van traditionele 3D-enteroïden 23,24,25 en permeabele ondersteunt26,27, en darmontsteking is onlangs gerepliceerd met darm-op-een-chip modellen28,29. Hoewel gut-on-a-chip-modellen met microfluïdica verreweg de meest geavanceerde en vertaalbare modellen zijn, is deze technologie duur, complex en ontoegankelijk voor de meeste onderzoekers30.
Recente ontwikkelingen in apiical-out enteroïde technieken hebben gemakkelijker toegang tot het apicale oppervlak van 3D-enteroïden mogelijk gemaakt zonder het risico te lopen de structurele integriteit van het in vitro epitheel te beschadigen 31,32,33. Apicale enteroïden delen de celtypesamenstelling en barrièrefunctie van in vivo darmepitheel, maar, in tegenstelling tot typische 3D-enteroïden, worden de apicale oppervlakken van deze cellen geconfronteerd met het kweekmedium, waardoor meer fysiologisch relevante studies mogelijk zijn over de absorptie van voedingsstoffen, microbiële infectie en luminale secretie31. Een bijkomend voordeel van apicale enteroïden is het vermogen om experimentele middelen homogeen te verdelen over enteroïden. Het variëren van behandelingsvolumes op basis van enteroïde grootte is niet vereist, zoals bij micro-injectie, en het vermogen om deze enteroïden in suspensiecultuur te houden, ontkent elke ECM-interferentie op experimentele agentdiffusie32.
Necrotiserende enterocolitis is een multifactoriële ziekte waarbij meerdere intestinale epitheelceltypen en een verscheidenheid aan omgevings- en pathofysiologische factorenbetrokken zijn 34. De gevarieerde celsamenstelling van intestinale enteroïden is een duidelijke verbetering ten opzichte van monoculturen bij het modelleren van een complexe ziekte zoals NEC. Interessant is dat, terwijl een enkele inflammatoire blootstelling vaak voldoende is om schade te veroorzaken in in vitro monoculturen, enteroïden, zoals bij muismodellen23, minimaal twee ontstekingscomponenten nodig lijken te hebben om NEC-achtige schade te induceren6. Hier presenteren we een apicale NEC-in-een-schotelmodel, met behulp van apicale enteroïden in combinatie met hypoxie (een belangrijk klinisch kenmerk van NEC6) en LPS- of TNF-α, als een verbeterd en meer fysiologisch relevant in vitro model om epitheliale reacties op NEC-achtige ontsteking te bestuderen en mogelijk therapeutische doelen te identificeren. We beschrijven een protocol voor het omkeren van de polariteit van dunne darm 3D-enteroïden, evenals een immunofluorescent kleuringsprotocol om epitheliale barrièreverstoring en junctionele eiwitexpressieveranderingen te identificeren. Ten slotte demonstreren we verder een eenvoudige enteroïde levensvatbaarheidstest om de impact van ons dual-hit, apiical-out NEC-in-a-dish-model te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De recente ontwikkeling van enteroïde modellen afgeleid van intestinale epitheliale crypten zorgt voor een meer fysiologisch relevant in vitro weefsel om necrotiserende enterocolitis pathogenese te bestuderen. Ondanks het feit dat alle belangrijke gedifferentieerde celtypen van het darmepitheel zijn opgenomen, zijn 3D-enteroïden nog steeds onderhevig aan verschillende significante beperkingen. De conventionele, basolaterale enteroïden worden gesuspendeerd in 3D ECM-hydrogelkoepels, waarvan de samenstelling en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. HC wordt ondersteund door subsidie P20GM134973 van de National Institutes of Health. KB wordt ondersteund door een Children’s Hospital Foundation (CHF) en Presbyterian Health Foundation (PHF) subsidie. We bedanken het Laboratorium voor Moleculaire Biologie en Cytometrie onderzoek van OUHSC voor het gebruik van de Core Facility, die confocale beeldvorming leverde.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
References
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
- Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
- Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), 7067-7079 (2011).
- Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
- Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
- De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
- Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
- Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
- Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
- Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
- Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
- Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
- Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
- Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
- Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).
