Этот протокол описывает модель апикального некротизирующего энтероколита (NEC) в чашке, использующую энтероиды тонкой кишки с обратной полярностью, позволяющую получить доступ к апикальной поверхности. Мы предоставляем протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения эпителиальных нарушений, связанных с NEC, и метод определения жизнеспособности апикальных энтероидов, подвергающихся протоколу NEC-in-a-dish.
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является разрушительным заболеванием, поражающим недоношенных детей, характеризующимся воспалением кишечника и некрозом. Энтероиды в последнее время стали перспективной системой для моделирования желудочно-кишечных патологий. Однако используемые в настоящее время методы энтероидных манипуляций либо не имеют доступа к апикальной поверхности эпителия (трехмерные [3D]), либо являются трудоемкими и ресурсоемкими (двумерные [2D] монослои). Эти методы часто требуют дополнительных шагов, таких как микроинъекция, чтобы модель стала физиологически переводимой. Здесь мы описываем физиологически значимый и недорогой протокол для изучения NEC in vitro путем обращения вспять энтероидной полярности, в результате чего апикальная поверхность обращена наружу (апикально-наружу). Также предусмотрен протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения целостности энтероидного барьера и экспрессии соединительного белка после воздействия фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) или липополисахарида (ЛПС) в нормоксических или гипоксических условиях. Также оценивается жизнеспособность 3D-апикально-ауттероидных энтероидов, подвергшихся воздействию нормоксических или гипоксических ЛПС или TNF-α в течение 24 ч. Энтероиды, подвергшиеся воздействию ЛПС или TNF-α в сочетании с гипоксией, демонстрировали нарушение эпителиальной архитектуры, потерю экспрессии белка соединения адгезий и снижение жизнеспособности клеток. Этот протокол описывает новую апикальную модель NEC-in-a-dish, которая представляет собой физиологически значимую и экономически эффективную платформу для выявления потенциальных эпителиальных целей для терапии NEC и изучения преждевременного кишечного ответа на терапию.
Некротизирующий энтероколит (НЭК), тяжелое воспалительное заболевание тонкой кишки, встречающееся у 10% недоношенных детей, обычно связано с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2. Показатели смертности, приближающиеся к 50% у младенцев с очень низкой массой тела при рождении (<1500 г), требующих хирургического вмешательства, не редкость3. Хотя точная этиология НЭК в настоящее время не понята, считается, что факторы риска, такие как искусственное вскармливание, сочетаются с физиологическими аномалиями, такими как дисбактериоз, незрелый кишечный эпителий и дисфункциональный кишечный барьер, в развитии заболевания 2,4. Несмотря на значительные усилия, за последнее десятилетие5 был достигнут незначительный прогресс в профилактике или лечении НЭК. Новый метод in vitro для изучения NEC и связанной с ним дисфункции кишечного эпителиального барьера необходим для углубления понимания патогенеза заболевания, поскольку результаты животных моделей до сих пор плохо переводились на прикроватную часть6.
Ряд моделей in vitro был использован для исследования механизмов, действующих во время NEC. Клеточная линия эпителия кишечника человека, Caco-2, является одной из наиболее часто используемых моделей IN VITRO NEC 7,8. Клетки Caco-2 имитируют морфологические особенности границы кисти тонкой кишки, но, как клеточная линия, не дифференцируются в широкий спектр типов клеток in vivo, включая слизь-продуцирующие бокалы, необходимые для высокотранслизируемой модели. HT-29-MTX, клетки аденокарциномы толстой кишки человека, включают смешанный фенотип энтероцитарных и бокаловидных клеток, но все еще не имеют типов клеток на основе крипты кишечного эпителия9. IEC-6 и IEC-18 являются нетрансформированными клеточными линиями с незрелой подвздошной криптоподобной морфологией, но не получены из тканей человека, что ограничивает их поступательную способность. Линии клеток кишечника FHs 74-Int и H4 получены из ткани плода человека и не образуют плотных соединений или поляризованных монослоев10,11 и, таким образом, являются незрелыми по сравнению даже с самыми недоношенными детьми, восприимчивыми к NEC. Как правило, модели NEC in vitro используют лечение липополисахаридами (LPS) для индуцирования толл-подобного рецептора 4 (TLR4), основного рецептора, инициирующего воспаление кишечника в NEC12. Повреждение, опосредованное обработкой активными формами кислорода (АФК), обычно через перекись водорода, часто используется для индуцирования NEC-подобного окислительного повреждения и апоптоза13,14. В качестве основного фактора воспаления кишечника фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), последующий компонент воспалительной передачи сигналов TLR4, также обычно используется в этих моделях in vitro для имитации патогенеза in vivo 15.
Органоиды, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), стали популярными в качестве модели кишечника in vitro из-за их способности повторять сложную архитектуру in vivo и клеточный состав ткани, из которой они получены16,17. Родственная система in vitro, энтероиды, представляют собой органоиды, полученные из резецированных кишечных крипт, которые легче установить и поддерживать, чем органоиды, полученные из iPSC. Энтероиды обычно выращиваются в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) с экспериментальным доступом, ограниченным базолатеральной клеточной поверхностью. Методы, такие как микроинъекция18,19, были разработаны для преодоления этого барьера на апикальной поверхности, но накопление слоистого клеточного мусора и слизи в просвете делает микроинъекцию как технически сложной, так и непоследовательной. Поскольку пользовательские роботизированные платформы микроинъекции не являются широко доступными20, лабораторная изменчивость технических возможностей и общей техники становится значительными переменными для преодоления с помощью протоколов микроинъекции. Двумерные (2D) монослои, полученные из диссоциированных 3D-энтероидов, все еще включающие все основные типы клеток кишечного эпителия, обеспечивают доступ к апикальной поверхности, но традиционно их трудно поддерживать без питающего слоя мезенхимальных миофибробластов21. В то время как проницаемые опоры клеточной культуры могут быть использованы для доступа как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам энтероидных монослоев без использования нижележащих миофибробластов, эти вставки требуют иссечения и монтажа мембраны перед использованием с такими модальностями, как конфокальная микроскопия, что приводит к более технически сложному и сложному процессу при использовании традиционных методов микроскопии22. NEC был смоделирован in vitro с использованием традиционных 3D-энтероидов 23,24,25 и проницаемых опор 26,27, а воспаление кишечника недавно было воспроизведено с моделями gut-on-a-chip28,29. В то время как модели «кишка на чипе», включающие микрофлюидику, на сегодняшний день являются самыми передовыми и переводимыми моделями, эта технология дорога, сложна и недоступна для большинства исследователей30.
Последние достижения в области апикальных энтероидных методов позволили облегчить доступ к апикальной поверхности 3D-энтероидов без риска повреждения структурной целостности эпителия in vitro 31,32,33. Апикальные энтероиды разделяют состав клеточного типа и барьерную функцию кишечного эпителия in vivo, но, в отличие от типичных 3D-энтероидов, апикальные поверхности этих клеток обращены к культуральной среде, что позволяет проводить более физиологически значимые исследования абсорбции питательных веществ, микробной инфекции и люминальной секреции31. Дополнительным преимуществом апикально-ауттероидов является способность гомогенно распределять экспериментальные агенты по энтероидам. Изменение объемов обработки в зависимости от размера энтероидов не требуется, как это происходит при микроинъекции, а способность поддерживать эти энтероиды в культуре суспензии сводит на нет любые интерференции ECM на экспериментальной диффузии агента32.
Некротизирующий энтероколит представляет собой многофакторное заболевание, включающее множественные типы эпителиальных клеток кишечника и различные факторы окружающей среды и патофизиологические факторы34. Разнообразный клеточный состав кишечных энтероидов является явным улучшением по сравнению с монокультурами в моделировании сложного заболевания, такого как NEC. Интересно, что в то время как одного воспалительного воздействия часто достаточно, чтобы вызвать повреждение монокультур in vitro , энтероиды, как и в случае с мышиными моделями23, по-видимому, требуют как минимум двух воспалительных компонентов, чтобы вызвать NEC-подобное повреждение6. Здесь мы представляем апикальную модель NEC-in-a-dish, использующую апикальные энтероиды в сочетании с гипоксией (важная клиническая особенность NEC6) и либо LPS, либо TNF-α, в качестве улучшенной и более физиологически значимой модели in vitro для изучения эпителиальных реакций на воспаление, подобное NEC, и, потенциально, определения терапевтических мишеней. Мы описываем протокол для изменения полярности 3D-энтероидов тонкой кишки, а также протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления нарушения эпителиального барьера и изменений экспрессии соединительного белка. Наконец, мы дополнительно демонстрируем простой анализ энтероидной жизнеспособности, чтобы определить влияние нашей модели NEC-in-a-dish с двойным ударом.
Недавняя разработка энтероидных моделей, полученных из кишечных эпителиальных крипт, позволяет получить более физиологически значимую ткань in vitro , в которой можно изучать патогенез некротизирующего энтероколита. Несмотря на включение всех основных дифференцированных типов кле…
The authors have nothing to disclose.
Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Мы благодарим Лабораторию молекулярной биологии и исследований цитометрии в OUHSC за использование Core Facility, которая обеспечивала конфокальную визуализацию.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
ImageJ | Fiji | N/A | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |