В пробирке Апикально-аутентоидная модель некротизирующего энтероколита

Summary

Этот протокол описывает модель апикального некротизирующего энтероколита (NEC) в чашке, использующую энтероиды тонкой кишки с обратной полярностью, позволяющую получить доступ к апикальной поверхности. Мы предоставляем протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения эпителиальных нарушений, связанных с NEC, и метод определения жизнеспособности апикальных энтероидов, подвергающихся протоколу NEC-in-a-dish.

Abstract

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является разрушительным заболеванием, поражающим недоношенных детей, характеризующимся воспалением кишечника и некрозом. Энтероиды в последнее время стали перспективной системой для моделирования желудочно-кишечных патологий. Однако используемые в настоящее время методы энтероидных манипуляций либо не имеют доступа к апикальной поверхности эпителия (трехмерные [3D]), либо являются трудоемкими и ресурсоемкими (двумерные [2D] монослои). Эти методы часто требуют дополнительных шагов, таких как микроинъекция, чтобы модель стала физиологически переводимой. Здесь мы описываем физиологически значимый и недорогой протокол для изучения NEC in vitro путем обращения вспять энтероидной полярности, в результате чего апикальная поверхность обращена наружу (апикально-наружу). Также предусмотрен протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения целостности энтероидного барьера и экспрессии соединительного белка после воздействия фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) или липополисахарида (ЛПС) в нормоксических или гипоксических условиях. Также оценивается жизнеспособность 3D-апикально-ауттероидных энтероидов, подвергшихся воздействию нормоксических или гипоксических ЛПС или TNF-α в течение 24 ч. Энтероиды, подвергшиеся воздействию ЛПС или TNF-α в сочетании с гипоксией, демонстрировали нарушение эпителиальной архитектуры, потерю экспрессии белка соединения адгезий и снижение жизнеспособности клеток. Этот протокол описывает новую апикальную модель NEC-in-a-dish, которая представляет собой физиологически значимую и экономически эффективную платформу для выявления потенциальных эпителиальных целей для терапии NEC и изучения преждевременного кишечного ответа на терапию.

Introduction

Некротизирующий энтероколит (НЭК), тяжелое воспалительное заболевание тонкой кишки, встречающееся у 10% недоношенных детей, обычно связано с высокой заболеваемостью и смертностью ^1,2. Показатели смертности, приближающиеся к 50% у младенцев с очень низкой массой тела при рождении (<1500 г), требующих хирургического вмешательства, не редкость³. Хотя точная этиология НЭК в настоящее время не понята, считается, что факторы риска, такие как искусственное вскармливание, сочетаются с физиологическими аномалиями, такими как дисбактериоз, незрелый кишечный эпителий и дисфункциональный кишечный барьер, в развитии заболевания ^2,4. Несмотря на значительные усилия, за последнее десятилетие⁵ был достигнут незначительный прогресс в профилактике или лечении НЭК. Новый метод in vitro для изучения NEC и связанной с ним дисфункции кишечного эпителиального барьера необходим для углубления понимания патогенеза заболевания, поскольку результаты животных моделей до сих пор плохо переводились на прикроватную часть⁶.

Ряд моделей in vitro был использован для исследования механизмов, действующих во время NEC. Клеточная линия эпителия кишечника человека, Caco-2, является одной из наиболее часто используемых моделей IN VITRO NEC ^7,8. Клетки Caco-2 имитируют морфологические особенности границы кисти тонкой кишки, но, как клеточная линия, не дифференцируются в широкий спектр типов клеток in vivo, включая слизь-продуцирующие бокалы, необходимые для высокотранслизируемой модели. HT-29-MTX, клетки аденокарциномы толстой кишки человека, включают смешанный фенотип энтероцитарных и бокаловидных клеток, но все еще не имеют типов клеток на основе крипты кишечного эпителия⁹. IEC-6 и IEC-18 являются нетрансформированными клеточными линиями с незрелой подвздошной криптоподобной морфологией, но не получены из тканей человека, что ограничивает их поступательную способность. Линии клеток кишечника FHs 74-Int и H4 получены из ткани плода человека и не образуют плотных соединений или поляризованных монослоев^10,11 и, таким образом, являются незрелыми по сравнению даже с самыми недоношенными детьми, восприимчивыми к NEC. Как правило, модели NEC in vitro используют лечение липополисахаридами (LPS) для индуцирования толл-подобного рецептора 4 (TLR4), основного рецептора, инициирующего воспаление кишечника в NEC¹². Повреждение, опосредованное обработкой активными формами кислорода (АФК), обычно через перекись водорода, часто используется для индуцирования NEC-подобного окислительного повреждения и апоптоза^13,14. В качестве основного фактора воспаления кишечника фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), последующий компонент воспалительной передачи сигналов TLR4, также обычно используется в этих моделях in vitro для имитации патогенеза in vivo ¹⁵.

Органоиды, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), стали популярными в качестве модели кишечника in vitro из-за их способности повторять сложную архитектуру in vivo и клеточный состав ткани, из которой они получены^16,17. Родственная система in vitro, энтероиды, представляют собой органоиды, полученные из резецированных кишечных крипт, которые легче установить и поддерживать, чем органоиды, полученные из iPSC. Энтероиды обычно выращиваются в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) с экспериментальным доступом, ограниченным базолатеральной клеточной поверхностью. Методы, такие как микроинъекция^18,19, были разработаны для преодоления этого барьера на апикальной поверхности, но накопление слоистого клеточного мусора и слизи в просвете делает микроинъекцию как технически сложной, так и непоследовательной. Поскольку пользовательские роботизированные платформы микроинъекции не являются широко доступными²⁰, лабораторная изменчивость технических возможностей и общей техники становится значительными переменными для преодоления с помощью протоколов микроинъекции. Двумерные (2D) монослои, полученные из диссоциированных 3D-энтероидов, все еще включающие все основные типы клеток кишечного эпителия, обеспечивают доступ к апикальной поверхности, но традиционно их трудно поддерживать без питающего слоя мезенхимальных миофибробластов²¹. В то время как проницаемые опоры клеточной культуры могут быть использованы для доступа как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам энтероидных монослоев без использования нижележащих миофибробластов, эти вставки требуют иссечения и монтажа мембраны перед использованием с такими модальностями, как конфокальная микроскопия, что приводит к более технически сложному и сложному процессу при использовании традиционных методов микроскопии²². NEC был смоделирован in vitro с использованием традиционных 3D-энтероидов 23,24,25 и проницаемых опор ^26,27, а воспаление кишечника недавно было воспроизведено с моделями gut-on-a-chip^28,29. В то время как модели «кишка на чипе», включающие микрофлюидику, на сегодняшний день являются самыми передовыми и переводимыми моделями, эта технология дорога, сложна и недоступна для большинства исследователей³⁰.

Последние достижения в области апикальных энтероидных методов позволили облегчить доступ к апикальной поверхности 3D-энтероидов без риска повреждения структурной целостности эпителия in vitro 31,32,33. Апикальные энтероиды разделяют состав клеточного типа и барьерную функцию кишечного эпителия in vivo, но, в отличие от типичных 3D-энтероидов, апикальные поверхности этих клеток обращены к культуральной среде, что позволяет проводить более физиологически значимые исследования абсорбции питательных веществ, микробной инфекции и люминальной секреции³¹. Дополнительным преимуществом апикально-ауттероидов является способность гомогенно распределять экспериментальные агенты по энтероидам. Изменение объемов обработки в зависимости от размера энтероидов не требуется, как это происходит при микроинъекции, а способность поддерживать эти энтероиды в культуре суспензии сводит на нет любые интерференции ECM на экспериментальной диффузии агента³².

Некротизирующий энтероколит представляет собой многофакторное заболевание, включающее множественные типы эпителиальных клеток кишечника и различные факторы окружающей среды и патофизиологические факторы³⁴. Разнообразный клеточный состав кишечных энтероидов является явным улучшением по сравнению с монокультурами в моделировании сложного заболевания, такого как NEC. Интересно, что в то время как одного воспалительного воздействия часто достаточно, чтобы вызвать повреждение монокультур in vitro , энтероиды, как и в случае с мышиными моделями²³, по-видимому, требуют как минимум двух воспалительных компонентов, чтобы вызвать NEC-подобное повреждение⁶. Здесь мы представляем апикальную модель NEC-in-a-dish, использующую апикальные энтероиды в сочетании с гипоксией (важная клиническая особенность NEC⁶) и либо LPS, либо TNF-α, в качестве улучшенной и более физиологически значимой модели in vitro для изучения эпителиальных реакций на воспаление, подобное NEC, и, потенциально, определения терапевтических мишеней. Мы описываем протокол для изменения полярности 3D-энтероидов тонкой кишки, а также протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления нарушения эпителиального барьера и изменений экспрессии соединительного белка. Наконец, мы дополнительно демонстрируем простой анализ энтероидной жизнеспособности, чтобы определить влияние нашей модели NEC-in-a-dish с двойным ударом.

Protocol

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. Образцы для удобства тонкой кишки от недоношенного нечеловеческого примата (NHP, 90% беременности, оливковый баб…

Representative Results

Использование энтероидов для моделирования воспаления кишечника, даже в контексте некротизирующего энтероколита, в настоящее время распространено. Однако большинство используемых в настоящее время способов либо не имеют доступа к апикальной поверхности энтероидов, что сводит на не?…

Discussion

Недавняя разработка энтероидных моделей, полученных из кишечных эпителиальных крипт, позволяет получить более физиологически значимую ткань in vitro , в которой можно изучать патогенез некротизирующего энтероколита. Несмотря на включение всех основных дифференцированных типов кле…

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5