In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Summary

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

Abstract

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

Introduction

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad ^1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes³. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barrera intestinal disfuncional, en el desarrollo de la enfermedad ^2,4. A pesar de los esfuerzos significativos, se ha avanzado poco en la prevención o el tratamiento de la ECN en la última década⁵. Se requiere un nuevo método in vitro para estudiar la ECN y la disfunción de la barrera epitelial intestinal asociada para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad, ya que los hallazgos de modelos animales, hasta ahora, se han traducido mal a la cabecera^6.

Se han utilizado varios modelos in vitro para investigar los mecanismos en juego durante la ECN. La línea celular epitelial intestinal humana, Caco-2, se encuentra entre los modelos in vitro más utilizados de NEC ^7,8. Las células Caco-2 emulan las características morfológicas del borde en cepillo del intestino delgado, pero, como línea celular, no se diferencian en la amplia variedad de tipos de células in vivo, incluidas las células caliciformes productoras de moco, requeridas para un modelo altamente traducible. HT-29-MTX, células de adenocarcinoma de colon humano, incluyen un fenotipo mixto de enterocito y cáliz, pero aún carecen de tipos de células basadas en criptas del epitelio intestinal⁹. IEC-6 e IEC-18 son líneas celulares no transformadas con una morfología ileal inmadura similar a la cripta pero no se derivan de tejido humano, lo que limita su capacidad de traducción. Las líneas celulares intestinales FH 74-Int y H4 se derivan del tejido fetal humano y no forman uniones estrechas ni monocapas polarizadas^10,11, y por lo tanto son inmaduras en comparación incluso con los bebés más prematuros susceptibles a la ECN. Por lo general, los modelos in vitro de NEC utilizan tratamientos de lipopolisacáridos (LPS) para inducir el receptor tipo toll 4 (TLR4), un receptor importante que inicia la inflamación intestinal en NEC¹². El daño mediado por el tratamiento con especies reactivas de oxígeno (ROS), típicamente a través del peróxido de hidrógeno, se utiliza a menudo para inducir daño oxidativo similar al NEC y apoptosis^13,14. Como principal impulsor de la inflamación intestinal, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), un componente posterior de la señalización inflamatoria TLR4, también se utiliza comúnmente en estos modelos in vitro para imitar la patogénesis in vivo ¹⁵.

Los organoides, generados a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs), han crecido en popularidad como modelo in vitro del intestino debido a su capacidad para recapitular la compleja arquitectura in vivo y la composición de tipo celular del tejido del que se derivan^16,17. Un sistema in vitro relacionado, los enteroides, son organoides derivados de criptas intestinales resecadas que son más fáciles de establecer y mantener que los organoides derivados de iPSC. Los enteroides se cultivan típicamente en una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) con acceso experimental limitado a la superficie celular basolateral. Se han desarrollado métodos, como la microinyección^18,19, para superar esta barrera a la superficie apical^, pero la acumulación de desechos celulares desprendidos y moco dentro del lumen hace que la microinyección sea técnicamente difícil e inconsistente. Como las plataformas de microinyección robótica personalizadas no son ampliamente accesibles²⁰, la variabilidad de laboratorio a laboratorio en la capacidad técnica y la técnica general se convierten en variables significativas para superar con los protocolos de microinyección. Las monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides 3D disociados, que aún comprenden todos los principales tipos celulares del epitelio intestinal, permiten el acceso a la superficie apical, pero tradicionalmente han sido difíciles de mantener sin una capa alimentadora de miofibroblastos mesenquimales²¹. Mientras que los soportes permeables al cultivo celular pueden ser utilizados para acceder tanto al lado apical como basolateral de monocapas enteroides sin el uso de miofibroblastos subyacentes, estos insertos requieren escisión y montaje de la membrana antes de su uso con modalidades como la microscopía confocal, lo que resulta en un proceso técnicamente más exigente y difícil cuando se utilizan métodos tradicionales de microscopía²². NEC se ha modelado in vitro utilizando enteroides 3D tradicionales 23,24,25 y soportes permeables 26,27, y la inflamación intestinal se ha replicado recientemente con modelos gut-on-a-chip^28,29. Si bien los modelos gut-on-a-chip que incorporan microfluídica son, con mucho, los modelos más avanzados y traducibles, esta tecnología es costosa, compleja e inaccesible para la mayoría de los investigadores³⁰.

Los avances recientes en las técnicas de enteroides apical-out han permitido un acceso más fácil a la superficie apical de enteroides 3D sin correr el riesgo de dañar la integridad estructural del epitelio in vitro ^31,32,33. Los enteroides apicales comparten la composición del tipo celular y la función de barrera del epitelio intestinal in vivo, pero, a diferencia de los enteroides 3D típicos, las superficies apicales de estas células se enfrentan al medio de cultivo, lo que permite estudios fisiológicamente más relevantes sobre la absorción de nutrientes, la infección microbiana y la secreción luminal³¹. Una ventaja adicional de los enteroides apicales es la capacidad de distribuir homogéneamente agentes experimentales a enteroides. No se requiere variar los volúmenes de tratamiento según el tamaño enteroide, como ocurre con la microinyección, y la capacidad de mantener estos enteroides en cultivo en suspensión niega cualquier interferencia de la ECM en la difusión del agente experimental³².

La enterocolitis necrosante es una enfermedad multifactorial que involucra múltiples tipos de células epiteliales intestinales y una variedad de factores ambientales y fisiopatológicos³⁴. La composición celular variada de los enteroides intestinales es una clara mejora sobre los monocultivos en el modelado de una enfermedad compleja como la ECN. Curiosamente, mientras que una sola exposición inflamatoria es a menudo suficiente para inducir daño en monocultivos in vitro , los enteroides, como con los modelos de ratón²³, parecen requerir un mínimo de dos componentes inflamatorios para inducir un daño similar al NEC⁶. Aquí, presentamos un modelo apical-out NEC-in-a-dish, utilizando enteroides apical-out en combinación con hipoxia (una característica clínica importante de NEC⁶) y LPS o TNF-α, como un modelo in vitro mejorado y fisiológicamente más relevante para estudiar las respuestas epiteliales a la inflamación similar a la ECN y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos. Describimos un protocolo para invertir la polaridad de enteroides 3D del intestino delgado, así como un protocolo de tinción inmunofluorescente para identificar la interrupción de la barrera epitelial y las alteraciones de la expresión de proteínas de unión. Finalmente, demostramos además un ensayo de viabilidad enteroide simple para determinar el impacto de nuestro modelo NEC-in-a-a-dish de doble golpe y salida apical.

Protocol

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Se obtuvieron muestras de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% de gestación, babuino olivo, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I). 1. Establecimiento del modelo enteroide apical-out NEC-in-…

Representative Results

El uso de enteroides para modelar la inflamación intestinal, incluso en el contexto de la enterocolitis necrosante, es ahora común. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados actualmente carecen de acceso a la superficie apical de los enteroides, negando la relevancia fisiológica de los compuestos destinados a su uso eventual como terapéutica oral, o son técnicamente difíciles y requieren mucho tiempo, como con las monocapas derivadas de enteroides. Para aumentar la utilidad de los modelos enteroides i…

Discussion

El reciente desarrollo de modelos enteroides derivados de criptas epiteliales intestinales permite un tejido in vitro fisiológicamente más relevante en el que estudiar la patogénesis necrosante de la enterocolitis. A pesar de incluir todos los principales tipos de células diferenciadas del epitelio intestinal, los enteroides 3D todavía están sujetos a varias limitaciones significativas. Los enteroides convencionales basolaterales están suspendidos en domos de hidrogel 3D ECM, cuya composición y densidad …

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5