In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Summary

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

Abstract

A enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora que afeta bebês prematuros, caracterizada por inflamação intestinal e necrose. Os enteróides surgiram recentemente como um sistema promissor para modelar patologias gastrointestinais. No entanto, atualmente utilizados métodos para manipulação enteróide ou não têm acesso à superfície apical do epitélio (tridimensional [3D]) ou são demorados e intensivos em recursos (monocamadas bidimensionais [2D]). Esses métodos muitas vezes requerem etapas adicionais, como a microinjeção, para que o modelo se torne fisiologicamente translacionável. Aqui, descrevemos um protocolo fisiologicamente relevante e barato para estudar nec in vitro , invertendo a polaridade enteroid, resultando na superfície apical voltada para fora (apical-out). Um protocolo de coloração imunofluorescente para examinar a integridade da barreira enteróide e a expressão da proteína juncional após a exposição ao fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α) ou lipopólise (LPS) sob condições normóxicas ou hipoxicas também são fornecidos. Também é avaliada a viabilidade de enteróides apical-out 3D expostos a LPS normóxicos ou hipoxicos ou TNF-α por 24 h. Enteroides expostos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, apresentaram interrupção da arquitetura epitelial, perda de expressão proteica de junção e redução da viabilidade celular. Este protocolo descreve um novo modelo nec-in-a-dish apical-out que apresenta uma plataforma fisiologicamente relevante e econômica para identificar potenciais alvos epiteliais para terapias NEC e estudar a resposta intestinal pré-clusão à terapêutica.

Introduction

A enterocolite necrosante (NEC), doença inflamatória grave do intestino delgado que ocorre em até 10% dos bebês prematuros, está comumente associada à alta morbidade e mortalidade ^1,2. As taxas de mortalidade que se aproximam de 50% em bebês com baixo peso ao nascer (<1500 g), que necessitam de intervenção cirúrgica, não são incomuns³. Embora a etiologia exata da NEC não seja compreendida atualmente, acredita-se que fatores de risco, como a alimentação de fórmulas, se compõem com anomalias fisiológicas, como disbiose, epitélio intestinal imaturo e barreira intestinal disfuncional, no desenvolvimento da doença ^2,4. Apesar do esforço significativo, pouco progresso na prevenção ou tratamento da NEC ocorreu na última década⁵. Um novo método in vitro para estudar nec e disfunção da barreira epitelial intestinal associada é necessário para avançar na compreensão da patogênese da doença, uma vez que os achados de modelos animais têm, até agora, traduzido mal para a cabeceira⁶.

Vários modelos in vitro foram utilizados para investigar os mecanismos em jogo durante a NEC. A linha de células epiteliais intestinais humanas, Caco-2, está entre os modelos in vitro mais utilizados da NEC ^7,8. As células caco-2 emulam características morfológicas da borda da escova do intestino delgado, mas, como linha celular, não se diferenciam na grande variedade de tipos de células in vivo, incluindo células de cálice produtoras de muco, necessárias para um modelo altamente traduzível. HT-29-MTX, células humanas de adenocarcinoma de cólon, incluem um fenótipo de células de cálice e cálice misto, mas ainda não possuem tipos de células baseadas em criptografia do epitélio^{intestinal 9}. IEC-6 e IEC-18 são linhas celulares não transformadas com uma morfologia imatura semelhante a criptologia ileal, mas não são derivadas do tecido humano, limitando sua capacidade translacional. As linhas de células intestinais FHs 74-Int e H4 são derivadas do tecido fetal humano e não formam junções apertadas ou monocamadas polarizadas^10,11, sendo assim imaturas em comparação até mesmo com os bebês mais prematuros suscetíveis à NEC. Tipicamente, os modelos in vitro nec utilizam tratamentos de lipopolisacarídeo (LPS) para induzir o receptor 4 (TLR4), um receptor importante que inicia inflamação intestinal na NEC¹². Os danos mediados através do tratamento reativo de espécies de oxigênio (ROS), tipicamente via peróxido de hidrogênio, é frequentemente usado para induzir danos oxidativos semelhantes à NEC e à apoptose^13,14. Como principal condutor da inflamação intestinal, o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), um componente a jusante da sinalização inflamatória TLR4, também é comumente utilizado nestes modelos in vitro para imitar a patogênese in vivo ¹⁵.

Os organoides, gerados a partir de células-tronco pluripotentes indutíveis (iPSCs), cresceram em popularidade como modelo in vitro do intestino devido à sua capacidade de recapitular a complexa arquitetura in vivo e a composição do tipo celular do tecido do qual são derivados^16,17. Um sistema in vitro relacionado, enteroids, são organoides derivados de criptas intestinais resseccionadas que são mais facilmente estabelecidas e mantidas do que organoides derivados do iPSC. Os enteróides são tipicamente cultivados em uma matriz extracelular tridimensional (3D) (ECM) com acesso experimental limitado à superfície celular basolateral. Métodos, como a microinjeção ^18,19, foram desenvolvidos para superar essa barreira à superfície apical, mas o acúmulo de detritos celulares e muco sloughed dentro do lúmen torna a microinjeção tecnicamente difícil e inconsistente. Como as plataformas de microinjeção robótica personalizadas não são amplamente acessíveis²⁰, a variabilidade de laboratório para laboratório em capacidade técnica e técnica geral tornam-se variáveis significativas para serem superadas com protocolos de microinjeção. Monocamadas bidimensionais (2D) derivadas de enteróides 3D dissociados, ainda compreendendo todos os principais tipos celulares do epitélio intestinal, permitem o acesso à superfície apical, mas têm sido tradicionalmente difíceis de manter sem uma camada alimentador de miofibroblasts^{mesenquimais 21}. Embora a cultura celular suportes permeáveis possam ser usados para acessar os lados apical e basolateral das monocamadas enteróides sem o uso de miofibroblasts subjacentes, essas inserções requerem excisão e montagem da membrana antes do uso com modalidades como microscopia confocal, resultando em um processo mais exigente e difícil ao usar métodos tradicionais de microscopia²². A NEC foi modelada in vitro usando enteróides 3D tradicionais 23,24,25 e suportes permeáveis ^26,27, e a inflamação intestinal foi recentemente replicada com modelos 3D-on-a-chip^28,29. Embora os modelos gut-on-a-chip que incorporam microfluidos sejam, de longe, os modelos mais avançados e traduzíveis, essa tecnologia é cara, complexa e inacessível para a maioria dos investigadores³⁰.

Os recentes avanços nas técnicas de enteroid apical-out permitiram acesso mais fácil à superfície apical de enteróides 3D sem correr o risco de danos à integridade estrutural do epitélio in vitro 31,32,33. Os enteróides apical-out compartilham a composição do tipo celular e a função de barreira do epitélio intestinal in vivo, mas, ao contrário dos enteróides 3D típicos, as superfícies apical dessas células enfrentam o meio da cultura, permitindo estudos mais fisiologicamente relevantes sobre absorção de nutrientes, infecção microbiana e secreção luminal³¹. Uma vantagem adicional dos enteróides apical-out é a capacidade de distribuir homogeneamente agentes experimentais para enteróides. Não é necessário variar os volumes de tratamento com base no tamanho do enteroid, como é com a microinjeção, e a capacidade de manter esses enteróides na cultura de suspensão nega qualquer interferência de ECM na difusão de agente experimental³².

Enterocolite necrosante é uma doença multifatorial que envolve múltiplos tipos de células epiteliais intestinais e uma variedade de fatores ambientais e fisiopacionológicos³⁴. A composição celular variada de enteróides intestinais é uma clara melhora sobre monoculturas na modelagem de uma doença complexa como a NEC. Curiosamente, enquanto uma única exposição inflamatória é muitas vezes suficiente para induzir danos em monoculturas in vitro , os enteróides, como acontece com os modelos de camundongos²³, parecem exigir um mínimo de dois componentes inflamatórios para induzir danos semelhantes à NEC⁶. Aqui, apresentamos um modelo nec-in-a-dish apical-out, usando enteróides apical-out em combinação com hipóxia (uma característica clínica importante da NEC⁶) e LPS ou TNF-α, como um modelo in vitro melhorado e mais fisiologicamente relevante para estudar respostas epiteliais à inflamação semelhante à NEC e, potencialmente, identificar alvos terapêuticos. Descrevemos um protocolo para reverter a polaridade de pequenos enteróides intestinais 3D, bem como um protocolo de coloração imunofluorescente para identificar a interrupção da barreira epitelial e alterações na expressão da proteína juncional. Finalmente, demonstramos ainda um simples ensaio de viabilidade enteroid para determinar o impacto do nosso modelo NEC-in-a-dish de dois sucessos.

Protocol

Todos os procedimentos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center. Amostras de conveniência do intestino delgado de um primata não humano pré-médio (NHP, 90% de gestação, babuíno de oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I). 1. Estabelecimento do modelo enteroid nec-in-a-dish apical-out Pre…

Representative Results

O uso de enteróides para modelar inflamação intestinal, mesmo dentro do contexto de enterocolite necrosante, agora é comum. No entanto, a maioria dos métodos atualmente utilizados ou não tem acesso à superfície apical dos enteróides, negando a relevância fisiológica dos compostos destinados a eventual uso como terapêutica oral, ou são tecnicamente difíceis e demorados, como acontece com as monocamadas derivadas de enteróides. Para aumentar a utilidade dos modelos enteroid in vitro atuais da NEC, i…

Discussion

O desenvolvimento recente de modelos enteróides derivados de criptes epiteliais intestinais permite um tecido in vitro mais fisiologicamente relevante no qual estudar a patogênese de enterocolite necrosante. Apesar de incluir todos os principais tipos de células diferenciadas do epitélio intestinal, os enteróides 3D ainda estão sujeitos a várias limitações significativas. Os enteróides convencionais de saída basolateral são suspensos em cúpulas de hidrogel 3D ECM, a composição e a densidade das qu…

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5