इन विट्रो में नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस का एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल
Summary
यह प्रोटोकॉल एक एपिकल-आउट नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) -इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो उलट ध्रुवीयता के साथ छोटे आंतों के एंटरॉइड का उपयोग करता है, जिससे एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति मिलती है। हम एनईसी से संबंधित उपकला व्यवधान का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एनईसी-इन-ए-डिश प्रोटोकॉल के अधीन एपिकल-आउट एंटरॉइड्स की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।
Abstract
नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) अपरिपक्व शिशुओं को प्रभावित करने वाली एक विनाशकारी बीमारी है, जो आंतों की सूजन और परिगलन की विशेषता है। एंटरॉइड्स हाल ही में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकृतियों को मॉडल करने के लिए एक आशाजनक प्रणाली के रूप में उभरे हैं। हालांकि, वर्तमान में एंटरॉइड हेरफेर के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों में या तो उपकला (त्रि-आयामी [3 डी]) की एपिकल सतह तक पहुंच की कमी है या समय लेने वाली और संसाधन-गहन (दो-आयामी [2 डी] मोनोलेयर) हैं। इन विधियों को अक्सर अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि माइक्रोइंजेक्शन, मॉडल को शारीरिक रूप से अनुवाद योग्य बनने के लिए। यहां, हम एंटरॉइड ध्रुवीयता को उलटकर इन विट्रो में एनईसी का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एपिकल सतह बाहर की ओर (एपिकल-आउट) का सामना करना पड़ता है। नॉरमोक्सिक या हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α) या लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) के संपर्क में आने के बाद एंटरॉइड बाधा अखंडता और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी प्रदान किया जाता है। 24 घंटे के लिए नॉर्मोक्सिक या हाइपोक्सिक एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले 3 डी एपिकल-आउट एंटरॉइड की व्यवहार्यता का भी मूल्यांकन किया जाता है। हाइपोक्सिया के साथ संयोजन में एलपीएस या टीएनएफ-α के संपर्क में आने वाले एंटरोइड्स ने उपकला वास्तुकला के विघटन, जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति का नुकसान और सेल व्यवहार्यता में कमी का प्रदर्शन किया। यह प्रोटोकॉल एक नए एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल का वर्णन करता है जो एनईसी उपचारों के लिए संभावित उपकला लक्ष्यों की पहचान करने और चिकित्सीय के लिए अपरिपक्व आंतों की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक और लागत प्रभावी मंच प्रस्तुत करता है।
Introduction
नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी), छोटी आंत की एक गंभीर भड़काऊ बीमारी जो 10% अपरिपक्व शिशुओं में होती है, आमतौर पर उच्च रुग्णता और मृत्यु दर 1,2 से जुड़ी होती है। बहुत कम जन्म के वजन (<1500 ग्राम) शिशुओं में 50% तक पहुंचने वाली मृत्यु दर, सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है, असामान्य नहीं हैं3. जबकि एनईसी के सटीक एटियलजि को वर्तमान में समझा नहीं गया है, जोखिम कारक, जैसे कि फॉर्मूला फीडिंग, को शारीरिक विसंगतियों के साथ यौगिक माना जाता है, जैसे कि डिस्बिओसिस, एक अपरिपक्व आंतों का उपकला, और एक बेकार आंतों की बाधा, रोग 2,4 के विकास में। महत्वपूर्ण प्रयास के बावजूद, पिछले दशक में एनईसी की रोकथाम या उपचार में बहुत कम प्रगति हुई है5. एनईसी और संबद्ध आंतों के उपकला बाधा शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास इन विट्रो विधि रोग के रोगजनन की समझ को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है, क्योंकि पशु मॉडल के निष्कर्षों ने अब तक बेडसाइड6 में खराब अनुवाद किया है।
एनईसी के दौरान खेलने वाले तंत्र की जांच करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल का उपयोग किया गया है। मानव आंतों की उपकला कोशिका रेखा, कैको -2, एनईसी 7,8 के इन विट्रो मॉडल में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली है। कैको -2 कोशिकाएं छोटी आंत की ब्रश सीमा रूपात्मक विशेषताओं का अनुकरण करती हैं, लेकिन, एक सेल लाइन के रूप में, विवो सेल प्रकारों की विस्तृत विविधता में अंतर नहीं करती हैं, जिसमें बलगम-उत्पादक गोबलेट कोशिकाएं शामिल हैं, जो अत्यधिक अनुवाद योग्य मॉडल के लिए आवश्यक हैं। एचटी -29-एमटीएक्स, मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं में एक मिश्रित एंटरोसाइट और गोबलेट सेल फेनोटाइप शामिल हैं, लेकिन अभी भी आंतों के उपकला 9 के क्रिप्ट-आधारित सेलप्रकारों की कमी है। आईईसी -6 और आईईसी -18 एक अपरिपक्व इलियल क्रिप्ट जैसी आकृति विज्ञान के साथ गैर-रूपांतरित सेल लाइनें हैं, लेकिन मानव ऊतक से प्राप्त नहीं होती हैं, जो उनकी अनुवाद क्षमता को सीमित करती हैं। एफएच 74-इंट और एच 4 आंतों की कोशिका रेखाएं मानव भ्रूण के ऊतकों से प्राप्त होती हैं और तंग जंक्शन या ध्रुवीकृत मोनोलेयर10,11 नहीं बनाती हैं, और इस प्रकार एनईसी के लिए अतिसंवेदनशील सबसे समय से पहले शिशुओं की तुलना में अपरिपक्व हैं। आमतौर पर, एनईसी इन विट्रो मॉडल टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) उपचार का उपयोग करते हैं, एनईसी12 में आंतों की सूजन शुरू करने वाला एक प्रमुख रिसेप्टर। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उपचार के माध्यम से मध्यस्थता की गई क्षति, आमतौर पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के माध्यम से, अक्सर एनईसी जैसी ऑक्सीडेटिव क्षति और एपोप्टोसिस13,14 को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाती है। आंतों की सूजन के मुख्य चालक के रूप में, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ-α), भड़काऊ टीएलआर 4 सिग्नलिंग का एक डाउनस्ट्रीम घटक, आमतौर पर इन इन विट्रो मॉडल में विवो रोगजनन15 में नकल करने के लिए भी उपयोग किया जाता है।
इंड्यूसिबल प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न ऑर्गेनोइड, विवो आर्किटेक्चर में कॉम्प्लेक्स को पुन: पेश करने की उनकी क्षमता और ऊतक की सेल-प्रकार की संरचना के कारण आंत के इन विट्रो मॉडल के रूप में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, जिससे वे16,17 प्राप्त होते हैं। एक संबंधित इन विट्रो सिस्टम, एंटरॉइड्स, विच्छेदित आंतों के क्रिप्ट से प्राप्त ऑर्गेनोइड हैं जो आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड की तुलना में अधिक आसानी से स्थापित और बनाए रखे जाते हैं। एंटरॉइड आमतौर पर एक त्रि-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में उगाए जाते हैं, जिसमें प्रयोगात्मक पहुंच बेसोलेटरल सेल सतह तक सीमित होती है। माइक्रोइंजेक्शन18,19 जैसे तरीके एपिकल सतह पर इस बाधा को दूर करने के लिए विकसित किए गए हैं, लेकिन लुमेन के भीतर सेलुलर मलबे और बलगम का निर्माण तकनीकी रूप से कठिन और असंगत दोनों माइक्रोइंजेक्शन प्रदान करता है। चूंकि कस्टम रोबोट माइक्रोइंजेक्शन प्लेटफ़ॉर्म व्यापक रूपसे सुलभ नहीं हैं, तकनीकी क्षमता और सामान्य तकनीक में प्रयोगशाला-से-प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ दूर करने के लिए महत्वपूर्ण चर बन जाती है। दो आयामी (2 डी) मोनोलेयर पृथक 3 डी एंटरॉइड्स से प्राप्त होते हैं, जिसमें अभी भी आंतों के उपकला के सभी प्रमुख सेल प्रकार शामिल हैं, एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देते हैं लेकिन पारंपरिक रूप से मेसेनकाइमल मायोफिब्रोब्लास्ट्स21 की फीडर परत के बिना बनाए रखना मुश्किल है। जबकि सेल संस्कृति पारगम्य समर्थन का उपयोग अंतर्निहित मायोफिब्रोब्लास्ट्स के उपयोग के बिना एंटरॉइड मोनोलेयर्स के एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों तक पहुंचने के लिए किया जा सकता है, इन आवेषणों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे तौर-तरीकों के साथ उपयोग करने से पहले झिल्ली के छांटना और बढ़ते की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक माइक्रोस्कोपी विधियों का उपयोग करते समय अधिक तकनीकी रूप से मांग और कठिन प्रक्रियाहोती है 22. एनईसी को पारंपरिक 3 डी एंटरॉइड्स23,24,25 और पारगम्य समर्थन 26,27 का उपयोग करके कृत्रिम परिवेशीय में मॉडलिंग की गई है, और आंतों की सूजन को हाल ही में आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल 28,29 के साथ दोहराया गया है। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक्स को शामिल करने वाले आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल अब तक के सबसे उन्नत और अनुवाद योग्य मॉडल हैं, यह तकनीक महंगी, जटिल और अधिकांश जांचकर्ताओंके लिए दुर्गम है।
एपिकल-आउट एंटरॉइड तकनीकों में हालिया प्रगति ने इन विट्रो उपकला 31,32,33 की संरचनात्मक अखंडता को नुकसान पहुंचाए बिना3 डी एंटरॉइड की एपिकल सतह तक आसान पहुंच की अनुमति दी है। एपिकल-आउट एंटरॉइड विवो आंतों के उपकला में सेल प्रकार की संरचना और बाधा समारोह को साझा करते हैं, लेकिन, विशिष्ट 3 डी एंटरॉइड्स के विपरीत, इन कोशिकाओं की एपिकल सतहें संस्कृति माध्यम का सामना करती हैं, जिससे पोषक तत्व अवशोषण, माइक्रोबियल संक्रमण और ल्यूमिनल स्राव31 पर अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक अध्ययन की अनुमति मिलती है। एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का एक अतिरिक्त लाभ एंटरॉइड्स को प्रयोगात्मक एजेंटों को समरूप रूप से वितरित करने की क्षमता है। एंटरॉइड आकार के आधार पर अलग-अलग उपचार की मात्रा की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि यह माइक्रोइंजेक्शन के साथ है, और निलंबन संस्कृति में इन एंटरोइड्स को बनाए रखने की क्षमता प्रयोगात्मक एजेंट प्रसार32 पर किसी भी ईसीएम हस्तक्षेप को नकारती है।
नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस एक बहुआयामी बीमारी है जिसमें कई आंतों के उपकला कोशिका प्रकार और विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय और पैथोफिजियोलॉजिकल कारक शामिलहैं। आंतों के एंटरॉइड्स की विविध कोशिका संरचना एनईसी जैसी जटिल बीमारी के मॉडलिंग में मोनोकल्चर पर एक स्पष्ट सुधार है। दिलचस्प बात यह है कि, जबकि एक एकल भड़काऊ जोखिम अक्सर इन विट्रो मोनोकल्चर में क्षति को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होता है, एंटरोइड्स, माउस मॉडल23 के साथ, एनईसी जैसी क्षति को प्रेरित करने के लिए न्यूनतम दो भड़काऊ घटकों की आवश्यकता होती है6. यहां, हम हाइपोक्सिया (एनईसी6 की एक महत्वपूर्ण नैदानिक विशेषता) और या तो एलपीएस या टीएनएफ-α के संयोजन में एपिकल-आउट एंटरॉइड्स का उपयोग करके एक एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल प्रस्तुत करते हैं, एनईसी जैसी सूजन के लिए उपकला प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक बेहतर और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक के रूप में और संभावित रूप से, चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करें। हम उपकला बाधा व्यवधान और जंक्शनल प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए छोटे आंतों के 3 डी एंटरोइड्स की ध्रुवीयता को उलटने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, साथ ही एक इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रोटोकॉल भी। अंत में, हम आगे हमारे दोहरे हिट, एपिकल-आउट एनईसी-इन-ए-डिश मॉडल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक सरल एंटरॉइड व्यवहार्यता परख का प्रदर्शन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आंतों के उपकला क्रिप्ट से प्राप्त एंटरॉइड मॉडल का हालिया विकास इन विट्रो ऊतक में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक की अनुमति देता है जिसमें नेक्रोटाइजिंग एंटरोकोलाइटिस रोगजनन का अध्ययन करना है। आंत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है। एचसी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से अनुदान पी 20 जीएम 134973 द्वारा समर्थित किया गया है। केबी को चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन (सीएचएफ) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन (पीएचएफ) अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम कोर सुविधा के उपयोग के लिए ओयूएचएससी में आणविक जीवविज्ञान और साइटोमेट्री रिसर्च के लिए प्रयोगशाला का धन्यवाद करते हैं, जिसने कॉन्फोकल इमेजिंग प्रदान की।
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
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