In vitro Apical-out Enteroid modell av nekrotiserande enterokolit

Summary

Detta protokoll beskriver en apikal-ut nekrotiserande enterokolit (NEC) -i-en-skålmodell som använder små intestinala enteroider med omvänd polaritet, vilket möjliggör åtkomst till den apikala ytan. Vi tillhandahåller ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att detektera NEC-relaterade epitelstörningar och en metod för att bestämma livskraften hos apikala enteroider som utsätts för NEC-in-a-dish-protokollet.

Abstract

Nekrotiserande enterokolit (NEC) är en förödande sjukdom som drabbar för tidigt födda barn, kännetecknad av tarminflammation och nekros. Enteroider har nyligen framträtt som ett lovande system för att modellera gastrointestinala patologier. Men för närvarande används metoder för enteroid manipulation antingen saknar tillgång till epitelets apikala yta (tredimensionell [3D]) eller är tidskrävande och resurskrävande (tvådimensionella [2D] monolager). Dessa metoder kräver ofta ytterligare steg, såsom mikroinjektion, för att modellen ska bli fysiologiskt översättbar. Här beskriver vi ett fysiologiskt relevant och billigt protokoll för att studera NEC in vitro genom att vända enteroidpolaritet, vilket resulterar i att den apikala ytan vetter utåt (apikal-ut). Ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att undersöka enteroidbarriärens integritet och korsande proteinuttryck efter exponering för tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) eller lipopolysackarid (LPS) under normoxiska eller hypoxiska förhållanden tillhandahålls också. Viabiliteten hos 3D-apikala enteroider som utsätts för normoxiska eller hypoxiska LPS eller TNF-α i 24 timmar utvärderas också. Enteroider som utsattes för antingen LPS eller TNF-α, i kombination med hypoxi, uppvisade störningar i epitelarkitekturen, en förlust av adherens korsningsproteinuttryck och en minskning av cellviabiliteten. Detta protokoll beskriver en ny apikal-ut NEC-in-a-dish-modell som presenterar en fysiologiskt relevant och kostnadseffektiv plattform för att identifiera potentiella epitelmål för NEC-terapier och studera det prematura tarmsvaret på terapier.

Introduction

Nekrotiserande enterokolit (NEC), en allvarlig inflammatorisk sjukdom i tunntarmen som förekommer hos upp till 10% av för tidigt födda barn, är vanligtvis förknippad med hög sjuklighet och dödlighet ^1,2. Dödligheten närmar sig 50% hos spädbarn med mycket låg födelsevikt (<1500 g), som kräver kirurgisk ingrepp, är inte ovanliga³. Medan den exakta etiologin för NEC för närvarande inte är förstådd, tros riskfaktorer, såsom formelmatning, förvärras med fysiologiska anomalier, såsom dysbios, ett omoget tarmepitel och en dysfunktionell tarmbarriär, i utvecklingen av sjukdomen ^2,4. Trots betydande ansträngningar har få framsteg gjorts när det gäller förebyggande eller behandling av NEC under det senaste årtiondet⁵. En ny in vitro-metod för att studera NEC och tillhörande tarmepitelbarriärdysfunktion krävs för att öka förståelsen för sjukdomspatogenesen, eftersom resultat från djurmodeller hittills har översatts dåligt till sängkanten⁶.

Ett antal in vitro-modeller har använts för att undersöka mekanismerna som spelar in under NEC. Den humana tarmepitelcelllinjen, Caco-2, är bland de vanligaste in vitro-modellerna av NEC ^7,8. Caco-2-celler emulerar borstgränsmorfologiska egenskaper hos tunntarmen, men som en cellinje skiljer de sig inte åt i det stora utbudet av in vivo-celltyper, inklusive slemproducerande bägareceller, som krävs för en mycket översättbar modell. HT-29-MTX, humana kolon adenokarcinomceller, inkluderar en blandad enterocyt- och bägare cellfenotyp, men saknar fortfarande kryptbaserade celltyper av tarmepitelet⁹. IEC-6 och IEC-18 är icke-transformerade cellinjer med en omogen ileal kryptliknande morfologi men härrör inte från mänsklig vävnad, vilket begränsar deras translationella kapacitet. FHs 74-Int och H4 tarmcellinjer härrör från mänsklig fostervävnad och bildar inte täta korsningar eller polariserade monolager^10,11, och är därmed omogna jämfört med även de mest för tidigt födda barn som är mottagliga för NEC. Vanligtvis använder NEC in vitro-modeller lipopolysackarid (LPS) behandlingar för att inducera tollliknande receptor 4 (TLR4), en viktig receptor som initierar tarminflammation i NEC¹². Skador medierade genom behandling av reaktiva syrearter (ROS), vanligtvis via väteperoxid, används ofta för att inducera NEC-liknande oxidativ skada och apoptos^13,14. Som den främsta drivkraften för tarminflammation används tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α), en nedströms komponent i den inflammatoriska TLR4-signaleringen, också vanligtvis i dessa in vitro-modeller för att efterlikna in vivo-patogenes ¹⁵.

Organoider, genererade från inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC), har vuxit i popularitet som en in vitro-modell av tarmen på grund av deras förmåga att rekapitulera den komplexa in vivo-arkitekturen och celltypskompositionen hos vävnaden från vilken de härrör^16,17. Ett besläktat in vitro-system, enteroider, är organoider härledda från resekterade tarmkrypter som lättare kan etableras och underhållas än iPSC-härledda organoider. Enteroider odlas vanligtvis i en tredimensionell (3D) extracellulär matris (ECM) med experimentell åtkomst begränsad till den basolaterala cellytan. Metoder, såsom mikroinjektion^18,19, har utvecklats för att övervinna denna barriär mot den apikala ytan^, men uppbyggnaden av sloughed cellulärt skräp och slem i lumen gör mikroinjektion både tekniskt svårt och inkonsekvent. Eftersom anpassade robotmikroinjektionsplattformar inte är allmänt tillgängliga²⁰, blir lab-to-lab-variabilitet i teknisk förmåga och allmän teknik betydande variabler att övervinna med mikroinjektionsprotokoll. Tvådimensionella (2D) monolager härledda från dissocierade 3D-enteroider, som fortfarande består av alla större celltyper i tarmepitelet, möjliggör åtkomst till den apikala ytan men har traditionellt varit svåra att upprätthålla utan ett matarskikt av mesenkymala myofibroblaster²¹. Medan cellodlingspermeabla stöd kan användas för att komma åt både apikala och basolaterala sidor av enteroidmonolager utan användning av underliggande myofibroblaster, kräver dessa insatser excision och montering av membranet före användning med modaliteter som konfokalmikroskopi, vilket resulterar i en mer tekniskt krävande och svår process vid användning av traditionella mikroskopimetoder²². NEC har modellerats in vitro med traditionella 3D-enteroider 23,24,25 och permeabla stöder 26,27, och tarminflammation har nyligen replikerats med gut-on-a-chip-modeller ^28,29. Medan gut-on-a-chip-modeller som innehåller mikrofluidik är de överlägset mest avancerade och översättningsbara modellerna, är denna teknik dyr, komplex och otillgänglig för de flesta utredare³⁰.

De senaste framstegen inom apikal-out enteroidtekniker har möjliggjort enklare åtkomst till den apikala ytan av 3D-enteroider utan att riskera att skada den strukturella integriteten hos in vitro-epitelet^31,32,33. Apikala enteroider delar celltypskompositionen och barriärfunktionen hos in vivo tarmepitel, men till skillnad från typiska 3D-enteroider vetter de apikala ytorna på dessa celler mot odlingsmediet, vilket möjliggör mer fysiologiskt relevanta studier om näringsabsorption, mikrobiell infektion och luminalsekretion³¹. En ytterligare fördel med apikala enteroider är förmågan att homogent distribuera experimentella medel till enteroider. Varierande behandlingsvolymer baserat på enteroidstorlek krävs inte, som det är med mikroinjektion, och förmågan att upprätthålla dessa enteroider i suspensionskultur förnekar all ECM-interferens vid experimentell agentdiffusion³².

Nekrotiserande enterokolit är en multifaktoriell sjukdom som involverar flera tarmepitelcelltyper och en mängd olika miljö- och patofysiologiska faktorer³⁴. Den varierade cellsammansättningen av intestinala enteroider är en klar förbättring jämfört med monokulturer vid modellering av en komplex sjukdom som NEC. Intressant nog, medan en enda inflammatorisk exponering ofta är tillräcklig för att inducera skador i in vitro-monokulturer, verkar enteroider, som med musmodeller²³, kräva minst två inflammatoriska komponenter för att inducera NEC-liknande skada⁶. Här presenterar vi en apikal-ut NEC-in-a-dish-modell, med apikala enteroider i kombination med hypoxi (en viktig klinisk egenskap hos NEC⁶) och antingen LPS eller TNF-α, som en förbättrad och mer fysiologiskt relevant in vitro-modell för att studera epitelsvar på NEC-liknande inflammation och potentiellt identifiera terapeutiska mål. Vi beskriver ett protokoll för att vända polariteten hos tunntarmens 3D-enteroider, samt ett immunofluorescerande färgningsprotokoll för att identifiera epitelbarriärstörningar och korsande proteinuttrycksförändringar. Slutligen demonstrerar vi ytterligare en enkel enteroid viabilitetsanalys för att bestämma effekten av vår dual-hit, apikal-out NEC-in-a-dish-modell.

Protocol

Alla djurförsök i denna studie godkändes av University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tunntarmsprover från en prematur icke-mänsklig primat (NHP, 90% dräktighet, olivbabian, Papio anubis) erhölls efter eutanasi för en separat studie (protokoll #101523-16-039-I). 1. Upprättande av apikal-out enteroid NEC-in-a-dish-modell Beredning av media och enteroidbehandlingarOBS: När de har beretts enligt sta…

Representative Results

Användningen av enteroider för att modellera tarminflammation, även inom ramen för nekrotiserande enterokolit, är nu vanligt. De flesta metoder som för närvarande används saknar emellertid antingen tillgång till den apikala ytan av enteroider, vilket förnekar den fysiologiska relevansen av föreningar avsedda för eventuell användning som orala terapier, eller är tekniskt svåra och tidskrävande, som med enteroid-härledda monolager. För att öka användbarheten av nuvarande in vitro-enteroidmodel…

Discussion

Den senaste utvecklingen av enteroidmodeller härledda från tarmepitelkrypter möjliggör en mer fysiologiskt relevant in vitro-vävnad för att studera nekrotiserande enterokolitpatogenes. Trots att alla större differentierade celltyper i tarmepitelet inkluderas är 3D-enteroider fortfarande föremål för flera betydande begränsningar. De konventionella, basolaterala enteroiderna suspenderas i 3D ECM-hydrogelkupoler, vars sammansättning och densitet kan begränsa normal diffusion inom vävnadsodlingsmiljö…

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5