Protocole de sauvetage d’embryons pour l’hybridation interspécifique en courge
Summary
L’article décrit un protocole de sauvetage d’embryons pour la régénération d’embryons immatures issus de l’hybridation interspécifique de Cucurbita pepo et Cucurbita moschata. Le protocole peut être facilement reproduit et constituera une ressource importante pour les programmes de sélection de courges.
Abstract
L’hybridation interspécifique dans les cultures de Cucurbita (courge) est souhaitable pour élargir la variation génétique et pour l’introgression des allèles utiles. Les embryons immatures issus de ces larges croisements doivent être régénérés à l’aide de techniques appropriées de sauvetage d’embryons. Bien que cette technique soit bien établie pour de nombreuses cultures, il n’existe pas de description détaillée de la méthodologie appropriée pour les courges qui permettrait son application courante. Ici, nous décrivons un protocole de sauvetage d’embryons utile pour l’hybridation interspécifique de C. pepo et C. moschata. Pour identifier des combinaisons viables pour le sauvetage d’embryons, 24 croisements interspécifiques ont été effectués. La nouaison a été obtenue à partir de vingt-deux croisements, ce qui indique un taux de réussite de 92%. Cependant, la plupart des fruits obtenus étaient parthénocarpiques, avec des graines dépourvues d’embryons (graines vides). Une seule combinaison croisée contenait des embryons immatures qui pouvaient être régénérés à l’aide de milieux de croissance de plantes basaux. Au total, 10 embryons ont été sauvés du fruit interspécifique F1 , et le taux de réussite du sauvetage embryonnaire était de 80%. Le protocole de sauvetage des embryons développé ici sera utile pour l’hybridation interspécifique dans les programmes de sélection de courges.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) est un genre très diversifié de la famille des Cucurbitaceae qui contient 27 espèces différentes, dont cinq sont domestiquées1. Parmi ceux-ci, Cucurbita moschata, C. pepo et C. maxima sont les plus importants économiquement au monde. Aux États-Unis, C. moschata et C. pepo sont les deux espèces les plus importantes dans la production agricole. C. pepo se compose de quatre sous-espèces (ovifera, pepo, fraternel et gumala) qui contiennent des groupes de cultivars de courges d’été et d’hiver : crookneck, straightneck, gland, pétoncle, cocozelle, moelle végétale, courgette et citrouille 2,3,4,5. C. moschata se compose principalement de types de marchés de courges d’hiver, y compris le noyer cendré, le Dickinson et le groupe de fromages1. Les deux espèces sont morphologiquement et phénotypiquement diverses, avec C. pepo considéré pour son rendement, sa précocité, son habitude de croissance dans les buissons et divers traits de fruits, y compris la forme du fruit, la taille du fruit, la couleur de la chair et le motif de l’écorce. D’autre part, C. moschata est prisé pour son adaptation à la chaleur et à l’humidité, ainsi que pour sa résistance aux maladies et aux ravageurs 6,7. L’hybridation interspécifique entre C. moschata et C. pepo est non seulement une stratégie importante pour l’introgression des caractéristiques souhaitables entre les deux espèces, mais permet également l’élargissement de la base génétique dans les programmes de sélection 7,8.
Les premiers croisements entre C. moschata et C. pepo ont été effectués pour déterminer leur compatibilité et/ou leurs barrières taxonomiques 9,10,11, tandis que les études ultérieures se sont principalement concentrées sur le transfert des caractères souhaitables12,13,14. L’hybridation interspécifique entre les deux espèces a ciblé le transfert de caractères nouveaux tels qu’un mode de croissance buisson ou semi-arbuste et un rendement amélioré de C. pepo ainsi qu’une résistance aux maladies, une adaptabilité au stress abiotique et une vigueur accrue de C. moschata14,15,16. Par exemple, des croisements spécifiques entre C. pepo (P5) et C. moschata (MO3) ont entraîné un rendement en fruits plus élevé 13, tandis que les accessions de C. moschata (Nigerian Local et Menina) ont été largement utilisées comme principale source de résistance aux potyvirus dans les cultivars cultivés de C. pepo 17,18.
Des études antérieures ont montré que l’hybridation entre C. moschata et C. pepo est possible mais difficile 8,15. Les croisements interspécifiques pourraient aboutir à l’absence de nouaison (avortement), à des fruits parthénocarpiques dépourvus de graines viables (graines vides), à des fruits sans pépins où les embryons immatures ne se développent pas (sténospermocarpie) ou à des fruits avec peu d’embryons immatures qui peuvent être sauvés en plantes matures par le sauvetage d’embryons15,16. Par exemple, aucune graine viable n’a été obtenue en croisant C. pepo (reine de table, maternelle) avec C. moschata (gros fromage, paternel), mais le croisement réciproque a donné 57 graines viables issues de 134 pollinisations9. Hayase n’a obtenu des graines viables à partir de croisements de C. moschata et de C. pepo que lorsque des croisements ont été effectués à 04h00 du matin en utilisant du pollen stocké à 10 ° C pendant la nuit19. Baggett a croisé huit variétés différentes de C. moschata avec C. pepo (delicata) et a rapporté que sur 103 pollinisations totales, 83 fruits semblaient normaux avaient été obtenus, mais aucun d’entre eux ne contenait de graines viables8. Dans un croisement entre C. pepo (S179) et C. moschata (NK), Zhang et al. ont obtenu 15 fruits avec 2 994 graines, mais seulement 12 de ces graines étaient viables tandis que les autres ne présentaient qu’un développement rudimentaire. Ces études suggèrent que même si le croisement interspécifique entre C. moschata et C. pepo est très bénéfique, l’obtention de fruits avec des graines viables à partir des croisements est exigeante16.
Le sauvetage d’embryons a été suggéré comme une méthode appropriée pour surmonter les problèmes découlant d’embryons avortés précocement ou mal développés et est l’une des techniques de culture in vitro les plus anciennes et les plus efficaces pour la régénération d’embryons immatures16,20. Le sauvetage embryonnaire implique la culture in vitro d’embryons sous-développés/immatures, suivie d’un transfert dans un milieu nutritif stérile pour faciliter la récupération des plantules et, finalement, des plantes matures21. Bien que le sauvetage d’embryons soit couramment utilisé dans l’élevage de courges, il n’existe pas de description détaillée de la méthodologie appropriée qui permettrait son application courante. L’utilisation d’une technique de sauvetage d’embryons pour surmonter les obstacles à l’hybridation interspécifique chez les espèces de Cucurbita a été signalée dès 195422. Cependant, le succès du sauvetage d’embryons dans les premières études n’a pas été rapporté ou était très faible. Metwally et al. ont rapporté un taux de réussite de 10% (régénération en plantes matures) parmi 100 embryons hybrides interspécifiques sauvés d’un croisement entre C. pepo et C. martinezii23. Sisko et al. ont rapporté un taux de réussite variable de la régénération embryonnaire parmi les embryons obtenus à partir de différentes combinaisons croisées : le taux de régénération des hybrides obtenus en croisant C. maxima (Bos. Max) et C. pepo (ruée vers l’or) était de 15,5 %, pour C. pepo (courgette) et C. moschata (Hokaido) était de 20 %, tandis que pour C. pepo (ruée vers l’or) et C. moschata (Dolga), il était de 37,5 %24. Outre le génotype, les milieux et les conditions de culture in vitro sont des facteurs importants pour le succès de la technique25,26. Dans la présente étude, diverses combinaisons croisées entre C. moschata et C. pepo ont été testées, et une méthodologie simple pour utiliser la technique de sauvetage d’embryons dans les courges a été développée. La mise au point d’une technique simple et facilement reproductible de sauvetage d’embryons facilitera l’hybridation interspécifique et l’amélioration du germoplasme dans les programmes de sélection des courges.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe deux principaux goulots d’étranglement pour une hybridation interspécifique réussie entre C. moschata et C. pepo : la barrière de compatibilité croisée, qui est déterminée par la réactivité du génotype pour produire des embryons hybrides, et les barrières post-fécondation, qui entravent le développement d’embryons hybrides vers des graines normales. Comme indiqué précédemment pour les courges, le test de compatibilité croisée de la présente étude a révélé que la plu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, NRS Project No. FLA-TRC-006176 et l’Institut des sciences alimentaires et agricoles de l’Université de Floride.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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