Protocolo de Resgate de Embriões para Hibridização Interespecífica em Abóbora
Summary
O artigo descreve um protocolo de resgate embrionário para a regeneração de embriões imaturos derivados da hibridização interespecífica de Cucurbita pepo e Cucurbita moschata. O protocolo pode ser facilmente replicado e será um recurso importante para os programas de melhoramento de abóbora.
Abstract
A hibridação interespecífica em culturas de Cucurbita (abóbora) é desejável para ampliar a variação genética e para a introgressão de alelos úteis. Os embriões imaturos gerados a partir desses cruzamentos largos devem ser regenerados usando técnicas apropriadas de resgate embrionário. Embora esta técnica esteja bem estabelecida para muitas culturas, falta uma descrição detalhada da metodologia apropriada para a abóbora que permita sua aplicação de rotina. Aqui, descrevemos um protocolo de resgate embrionário útil para hibridização interespecífica de C. pepo e C . moschata. Para identificar combinações viáveis para o resgate embrionário, foram realizados 24 cruzamentos interespecíficos. A frutificação foi obtida a partir de vinte e dois cruzamentos, indicando uma taxa de sucesso de 92%. No entanto, a maioria dos frutos obtidos foi partenocárpica, com sementes desprovidas de embriões (sementes vazias). Apenas uma combinação cruzada continha embriões imaturos que poderiam ser regenerados usando meios basais de crescimento de plantas. Um total de 10 embriões foram resgatados do fruto interespecífico F1 , e a taxa de sucesso do resgate embrionário foi de 80%. O protocolo de resgate de embriões aqui desenvolvido será útil para hibridização interespecífica em programas de melhoramento de abóbora.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) é um género botânico pertencente à família Cucurbitaceae, que contém 27 espécies diferentes, das quais cinco são domesticadas1. Entre estes, Cucurbita moschata, C. pepo e C. maxima são os mais importantes economicamente em todo o mundo. Nos EUA, C. moschata e C. pepo são as duas espécies mais importantes na produção agrícola. C. pepo consiste em quatro subespécies (ovifera, pepo, fraternal e gumala) que contêm grupos de cultivares de abóbora de verão e inverno de crookneck, straightneck, bolota, vieira, cocozelle, medula vegetal, abobrinha e abóbora2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente em tipos de mercado de abóbora de inverno, incluindo butternut, Dickinson e queijo do grupo1. As duas espécies são morfologicamente e fenotipicamente diversas, com C. pepo considerado por seu rendimento, precocidade, hábito de crescimento do arbusto e diversas características da fruta, incluindo forma do fruto, tamanho do fruto, cor da polpa e padrão da casca. Por outro lado, C. moschata é valorizada por sua adaptação ao calor e à umidade, bem como à resistência a doenças e pragas 6,7. A hibridação interespecífica entre C. moschata e C. pepo não é apenas uma importante estratégia para a introgressão de características desejáveis entre as duas espécies, mas também permite a ampliação da base genética em programas de melhoramento 7,8.
Os primeiros cruzamentos entre C. moschata e C. pepo foram feitos para determinar sua compatibilidade e/ou barreiras taxonômicas 9,10,11, enquanto estudos posteriores se concentraram principalmente na transferência de características desejáveis 12,13,14. A hibridação interespecífica entre as duas espécies tem como alvo a transferência de novas características, como um hábito de crescimento de arbustos ou semi-arbustos e melhora do rendimento de C. pepo, juntamente com a resistência a doenças, adaptabilidade ao estresse abiótico e aumento do vigor de C. moschata14,15,16. Por exemplo, cruzamentos específicos entre C. pepo (P5) e C. moschata (MO3) resultaram em maior produtividade de frutos 13, enquanto os acessos de C. moschata (Nigerian Local e Menina) têm sido amplamente utilizados como fonte primária de resistência a potyvirus em cultivares de C. pepo cultivadas 17,18.
Estudos prévios mostraram que a hibridação entre C. moschata e C. pepo é possível, mas difícil 8,15. Os cruzamentos interespecíficos podem resultar em nenhum conjunto de frutos (aborto), frutos partenocárpicos desprovidos de sementes viáveis (sementes vazias), frutos sem sementes onde os embriões imaturos não se desenvolvem (estenospermocarpia) ou frutos com poucos embriões imaturos que podem ser resgatados em plantas maduras por meio do resgate embrionário15,16. Por exemplo, não foram obtidas sementes viáveis pelo cruzamento de C. pepo (rainha de mesa, maternal) com C. moschata (queijo grande, paterno), no entanto, o cruzamento recíproco resultou em 57 sementes viáveis de 134 polinizações9. A Hayase obteve sementes viáveis dos cruzamentos de C. moschata e C. pepo somente quando os cruzamentos foram feitos às 04:00 da manhã, utilizando pólen armazenado a 10 °C durante a noite19. Baggett cruzou oito variedades diferentes de C. moschata com C. pepo (delicata) e relatou que, de 103 polinizações totais, foram obtidos 83 frutos que pareciam normais, mas nenhum deles continha sementes viáveis8. Em um cruzamento entre C. pepo (S179) e C. moschata (NK), Zhang et al. obtiveram 15 frutos com 2.994 sementes, mas apenas 12 dessas sementes eram viáveis, enquanto as restantes apresentavam apenas desenvolvimento rudimentar. Esses estudos sugerem que, embora o cruzamento interespecífico entre C. moschata e C. pepo seja altamente benéfico, a obtenção de frutos com sementes viáveis a partir dos cruzamentos é exigente16.
O resgate embrionário tem sido sugerido como um método apropriado para superar problemas decorrentes de aborto precoce ou embriões pouco desenvolvidos e é uma das primeiras e mais bem-sucedidas técnicas de cultura in vitro para regeneração de embriões imaturos16,20. O resgate embrionário envolve a cultura in vitro de embriões subdesenvolvidos/imaturos, seguida de transferência para um meio nutriente estéril para facilitar a recuperação de plântulas e, finalmente, de plantas maduras21. Embora o resgate de embriões seja comumente usado na criação de abóbora, falta uma descrição detalhada da metodologia apropriada que permita sua aplicação de rotina. O uso da técnica de resgate embrionário para superar barreiras de hibridização interespecíficas em espécies de Cucurbita foi relatado já em 195422. No entanto, o sucesso do resgate de embriões nos primeiros estudos não foi relatado ou muito baixo. Metwally et al. relataram uma taxa de sucesso de 10% (regeneração em plantas maduras) entre 100 embriões híbridos interespecíficos resgatados de um cruzamento entre C. pepo e C. martinezii23. Sisko et al. relataram uma taxa variável de sucesso de regeneração embrionária entre embriões obtidos a partir de diferentes combinações cruzadas: a taxa de regeneração de híbridos obtidos pelo cruzamento de C. maxima (Bos. Max) e C. pepo (Corrida do Ouro) foi de 15,5%, para C. pepo (abobrinha) e C. moschata (Hokaido) foi de 20%, enquanto para C. pepo (Corrida do Ouro) e C. moschata (Dolga) foi de 37,5%24. Além do genótipo, as condições do meio e da cultura in vitro são fatores importantes para o sucesso da técnica25,26. No presente estudo, várias combinações cruzadas entre C. moschata e C. pepo foram testadas, e uma metodologia simples para utilizar a técnica de resgate embrionário em abóbora foi desenvolvida. O desenvolvimento de uma técnica de resgate embrionário simples e facilmente reprodutível facilitará a hibridização interespecífica e o aprimoramento do germoplasma em programas de melhoramento de abóbora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem dois gargalos principais para uma hibridização interespecífica bem-sucedida entre C. moschata e C. pepo: a barreira de compatibilidade cruzada, que é determinada pela capacidade de resposta do genótipo para produzir embriões híbridos, e as barreiras pós-fertilização, que dificultam o desenvolvimento de embriões híbridos para sementes normais. Conforme relatado anteriormente para a abóbora, o teste de compatibilidade cruzada no presente estudo revelou que a maioria dos frutos se dese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 e o Instituto de Ciências Alimentares e Agrárias da Universidade da Flórida.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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