Protocolo de rescate embrionario para hibridación interespecífica en calabaza
Summary
El artículo describe un protocolo de rescate embrionario para la regeneración de embriones inmaduros derivado de la hibridación interespecífica de Cucurbita pepo y Cucurbita moschata. El protocolo se puede replicar fácilmente y será un recurso importante para los programas de cría de calabazas.
Abstract
La hibridación interespecífica en cultivos de Cucurbita (calabaza) es deseable para ampliar la variación genética y para la introgresión de alelos útiles. Los embriones inmaduros generados a partir de estos cruces anchos deben regenerarse utilizando técnicas apropiadas de rescate embrionario. Aunque esta técnica está bien establecida para muchos cultivos, falta una descripción detallada de la metodología adecuada para la calabaza que permita su aplicación rutinaria. Aquí, describimos un protocolo de rescate embrionario útil para la hibridación interespecífica de C. pepo y C . moschata. Para identificar combinaciones viables para el rescate embrionario, se realizaron 24 cruces interespecíficos. El cuajado se obtuvo a partir de veintidós cruces, lo que indica una tasa de éxito del 92%. Sin embargo, la mayoría de los frutos obtenidos eran partenocárpicos, con semillas desprovistas de embriones (semillas vacías). Solo una combinación cruzada contenía embriones inmaduros que podían regenerarse utilizando medios de crecimiento basal de plantas. Un total de 10 embriones fueron rescatados de la fruta F1 interespecífica, y la tasa de éxito del rescate de embriones fue del 80%. El protocolo de rescate de embriones desarrollado aquí será útil para la hibridación interespecífica en programas de cría de calabazas.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) es un género muy diverso en la familia Cucurbitaceae que contiene 27 especies diferentes, de las cuales cinco son domesticadas1. Entre estos, Cucurbita moschata, C. pepo y C. maxima son los más importantes económicamente a nivel mundial. En los Estados Unidos, C. moschata y C. pepo son las dos especies más importantes en la producción agrícola. C. pepo consiste en cuatro subespecies (ovifera, pepo, fraternal y gumala) que contienen grupos de cultivares de calabaza de verano e invierno de cuello torcido, cuello recto, bellota, vieira, cocozelle, médula vegetal, calabacín y calabaza 2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente en tipos de mercado de calabaza de invierno, incluyendo butternut, Dickinson y el grupode queso 1. Las dos especies son morfológica y fenotípicamente diversas, con C. pepo considerado por su rendimiento, precocidad, hábito de crecimiento de arbustos y diversos rasgos de la fruta que incluyen la forma de la fruta, el tamaño de la fruta, el color de la carne y el patrón de la corteza. Por otro lado, C. moschata es apreciada por su adaptación al calor y la humedad, así como por su resistencia a enfermedades y plagas 6,7. La hibridación interespecífica entre C. moschata y C. pepo no sólo es una estrategia importante para la introgresión de características deseables entre las dos especies, sino que también permite la ampliación de la base genética en los programas de mejoramiento 7,8.
Los primeros cruces entre C. moschata y C. pepo se realizaron para determinar su compatibilidad y/o barreras taxonómicas 9,10,11, mientras que estudios posteriores se centraron principalmente en la transferencia de rasgos deseables12,13,14. La hibridación interespecífica entre las dos especies se ha centrado en la transferencia de nuevos rasgos como un hábito de crecimiento arbustivo o semiarbusto y un mejor rendimiento de C. pepo junto con resistencia a enfermedades, adaptabilidad al estrés abiótico y mayor vigor de C. moschata14,15,16. Por ejemplo, cruces específicos entre C. pepo (P5) y C. moschata (MO3) han resultado en un mayor rendimiento de la fruta 13, mientras que las accesiones de C. moschata (Nigerian Local y Menina) han sido ampliamente utilizadas como la principal fuente de resistencia a potyvirus en cultivares cultivados de C. pepo 17,18.
Estudios previos mostraron que la hibridación entre C. moschata y C. pepo es posible pero difícil 8,15. Los cruces interespecíficos podrían resultar en ningún cuajado (aborto), frutos partenocárpicos desprovistos de semillas viables (semillas vacías), frutos sin semillas donde los embriones inmaduros no se desarrollan (estenospermocarpia), o frutos con pocos embriones inmaduros que pueden ser rescatados en plantas maduras a través del rescate de embriones15,16. Por ejemplo, no se obtuvieron semillas viables cruzando C. pepo (reina de mesa, materna) con C. moschata (queso grande, paterno), sin embargo, el cruce recíproco arrojó 57 semillas viables de 134 polinizaciones9. Hayase obtuvo semillas viables de cruces de C. moschata y C. pepo solo cuando se hicieron cruces a las 04:00 a.m. usando polen almacenado a 10 ° C durante la noche19. Baggett cruzó ocho variedades diferentes de C. moschata con C. pepo (delicata) e informó que de 103 polinizaciones totales, se obtuvieron 83 frutos que parecían normales, pero ninguno de ellos contenía semillas viables8. En un cruce entre C. pepo (S179) y C. moschata (NK), Zhang et al. obtuvieron 15 frutos con 2.994 semillas, pero solo 12 de esas semillas eran viables, mientras que el resto mostraba solo un desarrollo rudimentario. Estos estudios sugieren que a pesar de que el cruce interespecífico entre C. moschata y C. pepo es altamente beneficioso, la obtención de frutos con semillas viables de los cruces es exigente16.
El rescate embrionario ha sido sugerido como un método apropiado para superar los problemas derivados del aborto precoz o embriones poco desarrollados y es una de las técnicas de cultivo in vitro más tempranas y exitosas para la regeneración de embriones inmaduros16,20. El rescate embrionario implica el cultivo in vitro de embriones subdesarrollados/inmaduros, seguido de la transferencia a un medio nutriente estéril para facilitar la recuperación de las plántulas y, en última instancia, de las plantas maduras21. Aunque el rescate de embriones se usa comúnmente en la cría de calabazas, falta una descripción detallada de la metodología adecuada que permita su aplicación rutinaria. El uso de la técnica de rescate embrionario para superar las barreras de hibridación interespecífica en especies de Cucurbita se informó ya en 195422. Sin embargo, el éxito del rescate de embriones en los primeros estudios no se informó o fue muy bajo. Metwally et al. reportaron una tasa de éxito del 10% (regeneración en plantas maduras) entre 100 embriones híbridos interespecíficos rescatados de un cruce entre C. pepo y C. martinezii23. Sisko et al. reportaron una tasa de éxito variable de regeneración embrionaria entre embriones obtenidos de diferentes combinaciones cruzadas: la tasa de regeneración de híbridos obtenidos por cruce de C. maxima (Bos. Max) y C. pepo (Gold Rush) fue de 15,5%, para C. pepo (calabacín) y C. moschata (Hokaido) fue de 20%, mientras que para C. pepo (fiebre del oro) y C. moschata (Dolga) fue de 37,5%24. Además del genotipo, los medios y las condiciones de cultivo in vitro son factores importantes para el éxito de la técnica25,26. En el estudio actual, se probaron varias combinaciones cruzadas entre C. moschata y C. pepo, y se desarrolló una metodología simple para utilizar la técnica de rescate de embriones en calabaza. El desarrollo de una técnica de rescate embrionario simple y fácilmente reproducible facilitará la hibridación interespecífica y la mejora del germoplasma en los programas de mejoramiento de calabazas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos cuellos de botella principales para una hibridación interespecífica exitosa entre C. moschata y C. pepo: la barrera de compatibilidad cruzada, que está determinada por la capacidad de respuesta del genotipo para producir embriones híbridos, y las barreras posteriores a la fertilización, que dificultan el desarrollo de embriones híbridos a semillas normales. Como se informó anteriormente para la calabaza, la prueba de compatibilidad cruzada en el estudio actual reveló que la mayor parte d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA, Proyecto NRS No. FLA-TRC-006176 y el Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas de la Universidad de Florida.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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