Протокол спасения эмбрионов для межвидовой гибридизации в сквоше
Summary
В статье описан протокол спасения эмбрионов для регенерации незрелых эмбрионов, полученных в результате межвидовой гибридизации Cucurbita pepo и Cucurbita moschata. Протокол может быть легко воспроизведен и станет важным ресурсом для программ разведения сквоша.
Abstract
Межвидовая гибридизация в культурах Кукурбита (тыква) желательна для расширения генетической изменчивости и для интрогрессии полезных аллелей. Незрелые эмбрионы, полученные из этих широких скрещиваний, должны быть регенерированы с использованием соответствующих методов спасения эмбрионов. Хотя этот метод хорошо зарекомендовал себя для многих культур, подробное описание соответствующей методологии для кабачков, которая позволила бы его рутинное применение, отсутствует. Здесь мы опишем протокол спасения эмбрионов, полезный для межвидовой гибридизации C. pepo и C. moschata. Для выявления жизнеспособных комбинаций для спасения эмбрионов было выполнено 24 межвидовых скрещивания. Набор фруктов был получен из двадцати двух крестов, что указывает на 92% успеха. Однако большинство полученных плодов были партенокарпическими, с семенами, лишенными эмбрионов (пустые семена). Только одна перекрестная комбинация содержала незрелые эмбрионы, которые могли быть регенерированы с использованием базальных питательных сред растений. В общей сложности 10 эмбрионов были спасены из межвидового плода F1 , и показатель успеха спасения эмбрионов составил 80%. Разработанный здесь протокол спасения эмбрионов будет полезен для межвидовой гибридизации в программах разведения сквоша.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) является очень разнообразным родом в семействе Cucurbitaceae, который содержит 27 различных видов, из которых пять одомашнены1. Среди них Cucurbita moschata, C. pepo и C. maxima являются наиболее экономически важными во всем мире. В США C. moschata и C. pepo являются двумя наиболее важными видами в сельскохозяйственном производстве. C. pepo состоит из четырех подвидов (ovifera, pepo, fraternal и gumala), которые содержат как летние, так и зимние сортовые группы кабачков: кривошея, прямой шеи, желудя, гребешка, кокозель, кабачок, кабачки и тыква 2,3,4,5. C. moschata в основном состоит из зимних видов рынка кабачков, включая баттернат, Дикинсон и сыр группы1. Эти два вида морфологически и фенотипически разнообразны, причем C. pepo рассматривается за его урожайность, раннесть, привычку роста кустов и разнообразные признаки плодов, включая форму плода, размер плода, цвет мякоти и рисунок кожуры. С другой стороны, C. moschata ценится за адаптацию к теплу и влажности, а также устойчивость к болезням и вредителям 6,7. Межвидовая гибридизация между C. moschata и C. pepo является не только важной стратегией интрогрессии желательных характеристик между двумя видами, но и позволяет расширить генетическую базу в селекционных программах 7,8.
Ранние скрещивания между C. moschata и C. pepo были сделаны для определения их совместимости и/или таксономических барьеров 9,10,11, тогда как более поздние исследования в основном были сосредоточены на передаче желательных признаков 12,13,14. Межвидовая гибридизация между двумя видами была нацелена на передачу новых признаков, таких как привычка роста куста или полулеска и улучшение урожайности C. pepo наряду с устойчивостью к болезням, приспособляемостью к абиотическому стрессу и повышенной энергией от C. moschata 14,15,16. Например, специфические скрещивания между C. pepo (P5) и C. moschata (MO3) привели к повышению урожайности плодов13, в то время как C. moschata (нигерийские местные и menina) широко использовались в качестве основного источника устойчивости к потивирусам у культивируемых сортов C. pepo 17,18.
Предыдущие исследования показали, что гибридизация между C. moschata и C. pepo возможна, но затруднена 8,15. Межвидовые скрещивания могут привести к отсутствию плодового набора (аборт), партенокарпические плоды, лишенные жизнеспособных семян (пустые семена), бессемянные плоды, где незрелые эмбрионы не развиваются (стеноспермокарпия), или плоды с небольшим количеством незрелых эмбрионов, которые могут быть спасены в зрелые растения путем спасения эмбрионов15,16. Например, жизнеспособные семена не были получены путем скрещивания C. pepo (столовая матка, материнская) с C. moschata (крупный сыр, отцовский), однако реципрокное скрещивание дало 57 жизнеспособных семян из 134 опылений9. Хаясе получил жизнеспособные семена из скрещиваний C. moschata и C. pepo только тогда, когда кресты были сделаны в 04:00 утра с использованием пыльцы, хранящейся при 10 ° C в течение19 часов. Баггетт скрестил восемь различных сортов C. moschata с C. pepo (delicata) и сообщил, что из 103 общих опылений было получено 83 плода, которые казались нормальными, но ни один из них не содержал жизнеспособных семян8. В помеси C. pepo (S179) и C. moschata (NK) Zhang et al. получили 15 плодов с 2 994 семенами, но только 12 из этих семян были жизнеспособными, в то время как остальные демонстрировали только рудиментарное развитие. Эти исследования показывают, что, хотя межвидовое скрещивание между C. moschata и C. pepo очень полезно, получение плодов с жизнеспособными семенами из скрещиваний требует16.
Спасение эмбрионов было предложено в качестве подходящего метода для преодоления проблем, возникающих в результате раннего аборта или плохо развитых эмбрионов, и является одним из самых ранних и наиболее успешных методов культивирования in vitro для регенерации незрелых эмбрионов 16,20. Спасение эмбрионов включает в себя культуру in vitro недоразвитых/незрелых эмбрионов с последующим переносом в стерильную питательную среду для облегчения восстановления саженцев и, в конечном счете, зрелых растений21. Хотя спасение эмбрионов обычно используется в разведении сквоша, подробное описание соответствующей методологии, которая позволила бы его рутинное применение, отсутствует. Использование метода спасения эмбрионов для преодоления межвидовых барьеров гибридизации у видов Cucurbita было зарегистрировано еще в 1954году 22. Тем не менее, успех спасения эмбрионов в ранних исследованиях был либо незарегистрированным, либо очень низким. Metwally et al. сообщили о 10% успехе (регенерация в зрелые растения) среди 100 межвидовых гибридных эмбрионов, спасенных от скрещивания C. pepo и C. martinezii23. Sisko et al. сообщили о переменном уровне успеха регенерации эмбрионов среди эмбрионов, полученных из различных перекрестных комбинаций: скорость регенерации гибридов, полученных путем скрещивания C. maxima (Bos. Max) и C. pepo (Золотая лихорадка), составила 15,5%, для C. pepo (Zucchini) и C. moschata (Hokaido) составила 20%, в то время как для C. pepo (Золотая лихорадка) и C. moschata (Dolga) она составила 37,5%24. Помимо генотипа, среды и условия культивирования in vitro являются важными факторами успеха методики25,26. В текущем исследовании были протестированы различные перекрестные комбинации между C. moschata и C. pepo, и была разработана простая методология использования метода спасения эмбрионов в сквоше. Разработка простого и легко воспроизводимого метода спасения эмбрионов облегчит межвидовую гибридизацию и увеличение зародышевой плазмы в программах разведения сквоша.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует два основных узких места для успешной межвидовой гибридизации между C. moschata и C. pepo: барьер перекрестной совместимости, который определяется реакцией генотипа на получение гибридных эмбрионов, и барьеры постоплодотворения, которые препятствуют развитию гибридных ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, проект NRS No. FLA-TRC-006176 и Институт пищевых и сельскохозяйственных наук Университета Флориды.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
