Kabakta Interspesifik Hibridizasyon için Embriyo Kurtarma Protokolü
Summary
Makalede, Cucurbita pepo ve Cucurbita moschata’nın interspesifik hibridizasyonundan türetilen olgunlaşmamış embriyoların rejenerasyonu için bir embriyo kurtarma protokolü açıklanmaktadır. Protokol kolayca çoğaltılabilir ve kabak yetiştirme programları için önemli bir kaynak olacaktır.
Abstract
Cucurbita bitkilerinde (kabak) interspesifik hibridizasyon, genetik çeşitliliğin genişletilmesi ve yararlı alellerin içe girmesi için arzu edilir. Bu geniş haçlardan üretilen olgunlaşmamış embriyolar, uygun embriyo kurtarma teknikleri kullanılarak rejenere edilmelidir. Bu teknik birçok ürün için iyi kurulmuş olmasına rağmen, kabak için rutin uygulamasına izin verecek uygun metodolojinin ayrıntılı bir açıklaması eksiktir. Burada, C. pepo ve C. moschata’nın interspesifik hibridizasyonu için yararlı bir embriyo kurtarma protokolünü açıklıyoruz. Embriyo kurtarma için uygun kombinasyonları tanımlamak için, 24 interspesifik haç gerçekleştirildi. Meyve seti, yirmi iki haçtan elde edildi ve bu da% 92’lik bir başarı oranına işaret ediyor. Bununla birlikte, elde edilen meyvelerin çoğu, embriyolardan yoksun tohumlarla (boş tohumlar) partenokarpikti. Sadece bir çapraz kombinasyon, bazal bitki büyüme ortamı kullanılarak rejenere edilebilen olgunlaşmamış embriyolar içeriyordu. İnterspesifik F1 meyvesinden toplam10 embriyo kurtarıldı ve embriyo kurtarmanın başarı oranı% 80 idi. Burada geliştirilen embriyo kurtarma protokolü, kabak ıslah programlarında interspesifik hibridizasyon için faydalı olacaktır.
Introduction
Cucurbita (2n = 40), Cucurbitaceae familyasında, beşi1’i evcilleştirilmiş 27 farklı tür içeren oldukça çeşitli bir cinstir. Bunlar arasında, Cucurbita moschata, C. pepo ve C. maxima dünya çapında ekonomik açıdan en önemli olanlardır. ABD’de, C. moschata ve C. pepo, tarımsal üretimdeki en önemli iki türdür. C. pepo, crookneck, straightneck, meşe palamudu, tarak, cocozelle, sebze iliği, kabak ve balkabağı2,3,4,5’in hem yaz hem de kış kabak çeşitlerini içeren dört alt türden (ovifera, pepo, kardeşlik ve gumala) oluşur. C. moschata öncelikle butternut, Dickinson ve peynir grubu1 dahil olmak üzere kış kabağı pazar türlerinden oluşur. İki tür morfolojik ve fenotipik olarak çeşitlidir, C. pepo verimi, erkenciliği, çalı büyüme alışkanlığı ve meyve şekli, meyve büyüklüğü, et rengi ve kabuk deseni gibi çeşitli meyve özellikleri ile kabul edilir. Öte yandan, C. moschata, ısıya ve neme adaptasyonunun yanı sıra hastalık ve haşere direnci 6,7 için de ödüllendirilmiştir. C. moschata ve C. pepo arasındaki interspesifik hibridizasyon, sadece iki tür arasında arzu edilen özelliklerin tanıtılması için önemli bir strateji değil, aynı zamanda ıslah programlarında genetik tabanın genişletilmesine de izin verir 7,8.
C. moschata ve C. pepo arasındaki erken geçişler, uyumluluklarını ve / veya taksonomik bariyerlerini belirlemek için yapılmıştır9,10,11, daha sonraki çalışmalar çoğunlukla arzu edilen özelliklerin aktarılmasına odaklanmıştır12,13,14. İki tür arasındaki interspesifik hibridizasyon, bir çalı veya yarı çalı büyüme alışkanlığı gibi yeni özelliklerin transferini ve C. pepo’dan elde edilen verimin artmasını, hastalık direncini, abiyotik strese adaptasyonu ve C. moschata14,15,16’dan artan canlılığı hedeflemiştir. Örneğin, C. pepo (P5) ve C. moschata (MO3) arasındaki spesifik haçlar daha yüksek meyve verimi 13 ile sonuçlanırken, C. moschata katılımları (Nijerya Yerel ve Menina), ekili C. pepo çeşitlerinde potyvirüslere karşı birincil direnç kaynağı olarak yaygın olarak kullanılmıştır17,18.
Önceki çalışmalar, C. moschata ve C. pepo arasındaki hibridizasyonun mümkün ancak zor olduğunu göstermiştir8,15. Spesifik haçlar meyve setinin (kürtaj), canlı tohumlardan yoksun partenokarpik meyvelerin (boş tohumlar), olgunlaşmamış embriyoların gelişemediği çekirdeksiz meyvelerin (stenospermokarpi) veya embriyo kurtarma yoluyla olgun bitkilere kurtarılabilecek az sayıda olgunlaşmamış embriyoya sahip meyvelerin15,16 ile sonuçlanmasına neden olabilir. Örneğin, C. pepo’yu (sofra kraliçesi, anne) C. moschata (büyük peynir, baba) ile geçerek canlı tohumlar elde edilmedi, ancak karşılıklı haç 134 tozlaşmadan 57 canlı tohum verdi9. Hayase, C. moschata ve C. pepo haçlarından canlı tohumlar elde etti, ancak haçlar gece19’da 10 ° C’de depolanan polenler kullanılarak sabah 04: 00’te yapıldığında. Baggett, C. pepo (delicata) ile sekiz farklı C. moschata çeşidini geçti ve toplam 103 tozlaşmadan normal görünen 83 meyvenin elde edildiğini, ancak hiçbirinin canlı tohumiçermediğini bildirdi. C. pepo (S179) ve C. moschata (NK) arasındaki bir haçta, Zhang ve ark. 2.994 tohumla 15 meyve elde ettiler, ancak bu tohumlardan sadece 12’si yaşayabilirken, geri kalanlar sadece ilkel gelişim gösterdi. Bu çalışmalar, C. moschata ve C. pepo arasındaki interspesifik geçişin oldukça faydalı olmasına rağmen, haçlardan canlı tohumlarla meyve elde etmenin16 talep ettiğini göstermektedir.
Embriyo kurtarma, erken kürtaj veya az gelişmiş embriyolardan kaynaklanan sorunların üstesinden gelmek için uygun bir yöntem olarak önerilmiştir ve olgunlaşmamış embriyoların rejenerasyonu için en erken ve en başarılı in vitro kültür tekniklerinden biridir16,20. Embriyo kurtarma, az gelişmiş / olgunlaşmamış embriyoların in vitro kültürünü ve ardından fidelerin ve nihayetinde olgun bitkilerin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için steril bir besin ortamına transferini içerir21. Embriyo kurtarma, kabak yetiştiriciliğinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, rutin uygulamasına izin verecek uygun metodolojinin ayrıntılı bir açıklaması eksiktir. Cucurbita türlerinde interspesifik hibridizasyon engellerinin üstesinden gelmek için embriyo kurtarma tekniğinin kullanılması, 1954 gibi erken bir tarihte rapor edilmiştir22. Bununla birlikte, erken çalışmalarda embriyo kurtarmanın başarısı ya bildirilmemiş ya da çok düşüktü. Metwally ve ark., C. pepo ve C. martinezii23 arasındaki bir haçtan kurtarılan 100 interspesifik hibrid embriyo arasında% 10’luk bir başarı oranı (olgun bitkilere rejenerasyon) bildirmiştir. Sisko ve ark., farklı çapraz kombinasyonlardan elde edilen embriyolar arasında embriyo rejenerasyonunun değişken bir başarı oranını bildirmişlerdir: C. maxima (Bos. Max) ve C. pepo’yu (Altına Hücum) geçerek elde edilen melezlerin rejenerasyon oranı %15.5, C. pepo (Kabak) ve C. moschata (Hokaido) için %20, C. pepo (Altına Hücum) ve C. moschata (Dolga) için ise %37.5 24 idi. Genotipe ek olarak, media ve in vitro kültür koşulları tekniğin başarısı için önemli faktörlerdir25,26. Bu çalışmada, C. moschata ve C. pepo arasındaki çeşitli çapraz kombinasyonlar test edilmiş ve kabakta embriyo kurtarma tekniğini kullanmak için basit bir metodoloji geliştirilmiştir. Basit ve kolayca tekrarlanabilir bir embriyo kurtarma tekniğinin geliştirilmesi, kabak ıslah programlarında interspesifik hibridizasyonu ve germplazma geliştirmesini kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. moschata ve C. pepo arasında başarılı bir interspesifik hibridizasyon için iki ana darboğaz vardır: hibrid embriyolar üretmek için genotip duyarlılığı ile belirlenen çapraz uyumluluk bariyeri ve hibrid embriyoların normal tohumlara gelişimini engelleyen döllenme sonrası engeller. Kabak için daha önce bildirildiği gibi, mevcut çalışmadaki çapraz uyumluluk testi, meyvenin çoğunun partenokarpik olarak geliştiğini ve tohumların çoğunun dayanılmaz olduğunu ortaya koymuşt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, NRS Proje No tarafından desteklenmiştir. FLA-TRC-006176 ve Florida Üniversitesi Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
