스쿼시에서 종간 교잡화를 위한 배아 구조 프로토콜
Summary
이 기사는 Cucurbita pepo와 Cucurbita moschata의 종간 교잡에서 파생 된 미성숙 배아의 재생을위한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 복제 할 수 있으며 스쿼시 육종 프로그램에 중요한 자원이 될 것입니다.
Abstract
Cucurbita 작물 (스쿼시)에서의 종간 교잡은 유전 적 변이를 확대하고 유용한 대립 유전자의 침입에 바람직합니다. 이러한 넓은 십자가에서 생성 된 미성숙 배아는 적절한 배아 구조 기술을 사용하여 재생되어야합니다. 이 기술은 많은 작물에 대해 잘 확립되어 있지만 일상적인 적용을 허용하는 스쿼시에 대한 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. 여기에서는 C. pepo와 C. moschata의 종간 교잡에 유용한 배아 구조 프로토콜을 설명합니다. 배아 구조를위한 실행 가능한 조합을 확인하기 위해, 24 개의 종간 교차가 수행되었다. 과일 세트는 22 개의 십자가에서 얻어졌으며 92 %의 성공률을 나타냅니다. 그러나 얻은 과일의 대부분은 배아가없는 씨앗 (빈 씨앗)이있는 단과피였습니다. 단 하나의 교차 조합만이 기초 식물 성장 배지를 사용하여 재생될 수 있는 미성숙 배아를 포함했습니다. 종간F1 열매에서 총 10 개의 배아가 구출되었으며, 배아 구조 성공률은 80 %였다. 여기에서 개발 된 배아 구조 프로토콜은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡에 유용 할 것입니다.
Introduction
Cucurbita (2n = 40)는 27 종의 다른 종을 포함하는 Cucurbitaceae 계통의 매우 다양한 속이며 그 중 5 종은 길 들여집니다1. 이 중 Cucurbita moschata, C. pepo 및 C. maxima는 전 세계적으로 경제적으로 가장 중요합니다. 미국에서 C. moschata와 C. pepo는 농업 생산에서 가장 중요한 두 종입니다. C. pepo는 여름과 겨울 호박 품종 그룹을 모두 포함하는 4 개의 아종 (ovifera, pepo, fraternal 및 gumala)으로 구성됩니다. C. moschata는 주로 버터넛, 디킨슨, 치즈 그룹1을 포함한 겨울 스쿼시 시장 유형으로 구성됩니다. 두 종은 형태 학적으로나 표현형적으로 다양하며 C. pepo는 수확량, 얼얼함, 덤불 성장 습관 및 과일 모양, 과일 크기, 과육 색상 및 껍질 패턴을 포함한 다양한 과일 특성으로 간주됩니다. 반면에 C. moschata는 열과 습도, 질병 및 해충 저항성 6,7에 대한 적응으로 높이 평가됩니다. C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교잡은 두 종 사이의 바람직한 특성을 침해하는 중요한 전략 일뿐만 아니라 육종 프로그램 7,8에서 유전 적 기반을 넓힐 수 있습니다.
C. moschata와 C. pepo 사이의 초기 교배는 호환성 및 / 또는 분류 학적 장벽 9,10,11을 결정하기 위해 이루어졌지만 후기 연구는 주로 바람직한 특성12,13,14를 전달하는 데 중점을 두었습니다. 두 종 간의 종간 교잡은 질병 저항성, 비 생물 적 스트레스에 대한 적응성 및 C. moschata14,15,16의 활력 증가와 함께 부시 또는 반 부시 성장 습관 및 C. pepo의 수확량 향상과 같은 새로운 특성의 전달을 목표로했습니다. 예를 들어, C. pepo (P5)와 C. moschata (MO3) 사이의 특정 교배는 더 높은 과일 수확량 13을 초래 한 반면, C. moschata 가입 (나이지리아 지역 및 메니나)은 재배 된 C. pepo 품종17,18에서 포티 바이러스에 대한 내성의 주요 원천으로 널리 사용되었습니다.
이전 연구에 따르면 C. moschata와 C. pepo 사이의 교잡은 가능하지만 어렵습니다 8,15. 종간 교배는 과일 세트 없음 (낙태), 생존 가능한 씨앗이없는 단과피 과일 (빈 씨앗), 미성숙 배아가 발달하지 않는 씨없는 과일 (stenospermocarpy) 또는 배아 구조를 통해 성숙한 식물로 구출 될 수있는 미성숙 배아가 거의없는 과일15,16. 예를 들어, C. pepo (테이블 퀸, 모계)와 C. moschata (큰 치즈, 부계)를 교배하여 생존 가능한 종자를 얻지 못했지만, 상호 교배는 134 개의 수분에서 57 개의 생존 가능한 종자를 산출했습니다9. 하야세는 10°C에서 밤새 보관된 꽃가루를 사용하여 오전 04:00에 교배를 한 경우에만 C. moschata 및 C. pepo 교배종으로부터 생존 가능한 종자를 얻었다19. Baggett는 8 개의 다른 C. moschata 품종을 C. pepo (delicata)와 교배했으며 총 103 개의 수분 중 83 개의 과일이 정상으로 보였지만 그 중 어느 것도 생존 가능한 종자를 포함하지 않았다고보고했습니다8. C. pepo (S179)와 C. moschata (NK)의 교배에서 Zhang 등은 2,994 개의 종자로 15 개의 과일을 얻었지만 그 중 12 개만 생존 할 수 있었고 나머지는 초보적인 발달 만 보였습니다. 이 연구는 C. moschata와 C. pepo 사이의 종간 교배가 매우 유익하지만 십자가에서 생존 가능한 씨앗으로 과일을 얻는 것은16을 요구한다는 것을 시사합니다.
배아 구조는 조기 낙태 또는 잘 발달되지 않은 배아에서 발생하는 문제를 극복하기 위한 적절한 방법으로 제안되었으며 미성숙 배아의 재생을 위한 가장 초기의 가장 성공적인 시험관 배양 기술 중 하나입니다16,20. 배아 구조는 저개발 / 미성숙 배아의 시험관 내 배양에 이어 묘목 및 궁극적으로 성숙한 식물21의 회복을 촉진하기 위해 멸균 영양 배지로 옮기는 것을 포함합니다. 배아 구조는 일반적으로 스쿼시 육종에 사용되지만 일상적인 적용을 허용하는 적절한 방법론에 대한 자세한 설명이 부족합니다. Cucurbita 종에서 종간 교잡 장벽을 극복하기 위해 배아 구조 기술을 사용하는 것은 이미 195422 년에보고되었습니다. 그러나 초기 연구에서 배아 구조의 성공은보고되지 않았거나 매우 낮았다. Metwally et al. C. pepo와 C. martinezii23 사이의 교배에서 구출 된 100 개의 종간 잡종 배아 중 10 %의 성공률 (성숙한 식물로의 재생)을보고했습니다. Sisko et al. 서로 다른 교차 조합으로부터 얻은 배아 중 배아 재생의 다양한 성공률을보고했다 : C. maxima (Bos. Max)와 C. pepo (Gold Rush)를 교배하여 얻은 잡종의 재생률은 15.5 % 였고, C. pepo (Zucchini)와 C. moschata (Hokaido)는 20 % 였고, C. pepo (Gold Rush)와 C. moschata (Dolga)는 37.5 % 24였다. 유전자형 이외에, 배지 및 시험관 내 배양 조건은 기술25,26의 성공을위한 중요한 요소입니다. 현재 연구에서는 C. moschata와 C. pepo 사이의 다양한 교차 조합을 테스트하고 스쿼시에서 배아 구조 기술을 활용하기위한 간단한 방법론을 개발했습니다. 간단하고 쉽게 재현 가능한 배아 구조 기술의 개발은 스쿼시 육종 프로그램에서 종간 교잡 및 생식질 향상을 촉진할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. moschata와 C. pepo 사이의 성공적인 종간 교잡을위한 두 가지 주요 병목 현상이 있습니다 : 하이브리드 배아를 생산하기위한 유전자형 반응성에 의해 결정되는 교차 호환성 장벽과 정상 종자에 대한 하이브리드 배아의 발달을 방해하는 수정 후 장벽. 스쿼시에 대해 이전에보고 된 바와 같이, 현재 연구의 교차 호환성 테스트는 대부분의 과일이 parthenocarpically 발달했으며 대부분의 씨앗…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 USDA 국립 식량 농업 연구소, NRS 프로젝트 번호의 지원을 받았습니다. FLA-TRC-006176 및 플로리다 대학교 식품 및 농업 과학 연구소.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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