Embryo Rescue Protokoll for interspesifikk hybridisering i Squash
Summary
Artikkelen beskriver en embryoredningsprotokoll for regenerering av umodne embryoer avledet fra interspesifikk hybridisering av Cucurbita pepo og Cucurbita moschata. Protokollen kan enkelt replikeres og vil være en viktig ressurs for squash avl programmer.
Abstract
Interspesifikk hybridisering i Cucurbita-avlinger (squash) er ønskelig for å utvide genetisk variasjon og for introgresjon av nyttige alleler. Umodne embryoer generert fra disse brede kryssene må regenereres ved hjelp av passende embryoredningsteknikker. Selv om denne teknikken er godt etablert for mange avlinger, mangler en detaljert beskrivelse av riktig metodikk for squash som vil tillate rutinemessig bruk. Her beskriver vi en embryoredningsprotokoll som er nyttig for interspesifikk hybridisering av C. pepo og C. moschata. For å identifisere levedyktige kombinasjoner for embryoredning ble det utført 24 interspesifikke kryss. Fruktsett ble hentet fra tjueto kryss, noe som indikerer en suksessrate på 92%. Imidlertid var de fleste av fruktene som ble oppnådd parthenokarpiske, med frø uten embryoer (tomme frø). Bare en krysskombinasjon inneholdt umodne embryoer som kunne regenereres ved hjelp av basale plantevekstmedier. Totalt 10 embryoer ble reddet fra den interspesifikke F 1-frukten, og suksessraten for embryoredning var 80%. Embryoredningsprotokollen som er utviklet her, vil være nyttig for interspesifikk hybridisering i squashavlsprogrammer.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) er en svært mangfoldig slekt i Cucurbitaceae-familien som inneholder 27 forskjellige arter, hvorav fem er tamme1. Blant disse er Cucurbita moschata, C. pepo og C. maxima de økonomisk viktigste over hele verden. I USA er C. moschata og C. pepo de to viktigste artene i landbruksproduksjonen. C. pepo består av fire underarter (ovifera, pepo, broderlig og gumala) som inneholder både sommer og vinter squash kultivar grupper av crookneck, straightneck, eikenøtt, kamskjell, cocozelle, vegetabilsk marg, courgette og gresskar 2,3,4,5. C. moschata består hovedsakelig av vinter squash markedstyper, inkludert butternut, Dickinson og ost gruppe1. De to artene er morfologisk og fenotypisk forskjellige, med C. pepo ansett for utbytte, earliness, bush vekstvane og forskjellige fruktegenskaper, inkludert fruktform, fruktstørrelse, kjøttfarge og skallmønster. På den annen side er C. moschata verdsatt for sin tilpasning til varme og fuktighet, samt sykdom og skadedyrsbestandighet 6,7. Interspesifikk hybridisering mellom C. moschata og C. pepo er ikke bare en viktig strategi for introgresjon av ønskelige egenskaper mellom de to artene, men gir også mulighet for utvidelse av den genetiske basen i avlsprogrammer 7,8.
Tidlige krysninger mellom C. moschata og C. pepo ble gjort for å bestemme deres kompatibilitet og / eller taksonomiske barrierer 9,10,11, mens senere studier hovedsakelig fokuserte på å overføre ønskelige egenskaper12,13,14. Interspesifikk hybridisering mellom de to artene har målrettet overføring av nye egenskaper som en busk- eller halvbuskvekstvane og forbedret utbytte fra C. pepo sammen med sykdomsresistens, tilpasningsevne til abiotisk stress og økt kraft fra C. moschata14,15,16. For eksempel har spesifikke kryss mellom C. pepo (P5) og C. moschata (MO3) resultert i høyere fruktutbytte 13, mens C. moschata-tilganger (Nigerian Local og Menina) har blitt mye brukt som den primære kilden til resistens mot potyvirus i dyrkede C. pepo-kultivarer 17,18.
Tidligere studier viste at hybridisering mellom C. moschata og C. pepo er mulig, men vanskelig 8,15. De interspesifikke kryssene kan resultere i ingen fruktsett (abort), parthenokarpiske frukter uten levedyktige frø (tomme frø), frøfrie frukter der de umodne embryoene ikke klarer å utvikle seg (stenospermocarpy), eller frukt med få umodne embryoer som kan reddes til modne planter gjennom embryoredning15,16. For eksempel ble det ikke oppnådd levedyktige frø ved å krysse C. pepo (borddronning, mors) med C. moschata (stor ost, fader), men det gjensidige korset ga 57 levedyktige frø fra 134 pollineringer9. Hayase fikk levedyktige frø fra C. moschata og C. pepo kryss bare når kryss ble gjort kl 04:00 ved bruk av pollen lagret ved 10 ° C over natten19. Baggett krysset åtte forskjellige C. moschata-varianter med C. pepo (delicata) og rapporterte at av 103 totale pollineringer ble det oppnådd 83 frukter som virket normale, men ingen av dem inneholdt levedyktige frø8. I en krysning mellom C. pepo (S179) og C. moschata (NK) oppnådde Zhang og medarbeidere 15 frukter med 2 994 frø, men bare 12 av disse frøene var levedyktige mens de resterende bare viste rudimentær utvikling. Disse studiene tyder på at selv om interspesifikk kryssing mellom C. moschata og C. pepo er svært gunstig, er det krevende16 å skaffe frukt med levedyktige frø fra kryssene.
Embryoredning har blitt foreslått som en passende metode for å overvinne problemer som oppstår ved tidlig abort eller dårlig utviklede embryoer, og er en av de tidligste og mest vellykkede in vitro-kulturteknikkene for regenerering av umodne embryoer16,20. Embryoredning innebærer in vitro-kultur av underutviklede/umodne embryoer etterfulgt av overføring til et sterilt næringsmedium for å lette utvinningen av frøplanter og til slutt modne planter21. Selv om embryo redning er ofte brukt i squash avl, en detaljert beskrivelse av riktig metodikk som ville tillate sin rutinemessige anvendelse mangler. Bruk av embryoredningsteknikk for å overvinne interspesifikke hybridiseringsbarrierer i Cucurbita-arter ble rapportert så tidlig som 195422. Imidlertid var suksessen til embryoredning i de tidlige studiene enten urapportert eller svært lav. Metwally og medarbeidere rapporterte en suksessrate på 10% (regenerering til modne planter) blant 100 interspesifikke hybridembryoer reddet fra en krysning mellom C. pepo og C. martinezii23. Sisko og medarbeidere rapporterte en variabel suksessrate for embryoregenerering blant embryoer oppnådd fra forskjellige krysskombinasjoner: regenereringsgraden av hybrider oppnådd ved å krysse C. maxima (Bos. Max) og C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, for C. pepo (Zucchini) og C. moschata (Hokaido) var 20%, mens for C. pepo (Gold Rush) og C. moschata (Dolga) var den 37,5%24. I tillegg til genotype er media og in vitro-kulturforhold viktige faktorer for teknikkens suksess25,26. I den nåværende studien ble ulike krysskombinasjoner mellom C. moschata og C. pepo testet, og en enkel metodikk for å bruke embryoredningsteknikken i squash ble utviklet. Utviklingen av en enkel og lett reproduserbar embryoredningsteknikk vil legge til rette for interspesifikk hybridisering og germplasmforbedring i squashavlsprogrammer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er to hovedflaskehalser for vellykket interspesifikk hybridisering mellom C. moschata og C. pepo: krysskompatibilitetsbarriere, som bestemmes av genotyperespons for å produsere hybridembryoer, og postbefruktningsbarrierer, som hindrer utviklingen av hybridembryoer til normale frø. Som tidligere rapportert for squash, viste krysskompatibilitetstesten i den nåværende studien at det meste av frukten utviklet seg parthenokarpisk, med de fleste frøene unviable16. Foreldregeno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Prosjekt nr. FLA-TRC-006176 og University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
