快速有效地监测完整斑马鱼胚胎中正常和异常胞嘧啶甲基化的时空监测
Summary
本文描述了一种快速有效地对完整斑马鱼胚胎内正常和异常胞嘧啶甲基化进行时空监测的方案。
Abstract
胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种中高度保守，并且作为表观遗传编程和染色质状态的关键驱动因素，在早期胚胎发育中起着关键作用。酶修饰驱动胞嘧啶的活性甲基化和去甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），随后将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。表观遗传重编程是 子宫发育 过程中的关键时期，母体接触化学物质有可能重新编程后代中的表观基因组。这可能会导致不良结局，例如直接表型后果、对成人疾病易感性的长期影响以及遗传表观遗传标记的跨代影响。尽管基于亚硫酸氢盐的测序使研究人员能够以碱基对分辨率询问胞嘧啶甲基化，但基于测序的方法成本过高，因此，无法监测胞嘧啶甲基化跨发育阶段、每种化学物质的多种浓度以及每次治疗复制胚胎的能力。由于自动化 体内 成像、遗传操作、快速宫 外 发育时间和胚胎发生过程中的饲养易于，斑马鱼胚胎继续被用作生理上完整的模型，用于揭示异生素介导的途径，这些途径在早期胚胎发育期间导致不良结果。因此，使用市售的5-mC特异性抗体，我们描述了一种具有成本效益的策略，通过利用全卡口免疫组织化学，自动高内涵成像和统计分析前使用编程语言的高效数据处理，对单个完整斑马鱼胚胎中的胞嘧啶甲基化进行快速有效的时空监测。就目前所知，该方法是第一个在早期发育过程中成功检测和定量斑马鱼 胚胎内 5-mC水平的方法。该方法能够检测细胞团内的DNA甲基化，并且还能够在母体到合子过渡期间检测卵黄定位母体mRNA的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定在表观遗传重编程过程中有可能原 位 破坏胞嘧啶甲基化的化学物质。
Introduction
酶修饰驱动胞嘧啶的活性甲基化和去甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），随后将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶1，2。磷酸三（1，3-二氯-2-丙基）酯（TDCIPP）是美国广泛使用的阻燃剂，先前已被证明可以改变受精后0.75小时（hpf）到早期原肠胚形成（6 hpf）的早期胚胎暴露后胞嘧啶甲基化的轨迹3，4，5，6，7，8.在脊椎动物中，5-mC及其修饰的衍生物对于调节早期胚胎发育至关重要9。胚胎受精触发亲本DNA的去甲基化，随后是母体mRNA降解，合子基因组激活和合子基因组的再甲基化9。利用胞嘧啶甲基化的生物学相关过程包括组蛋白修饰、转录机制募集、RNA 甲基化、表观遗传重编程和染色质结构的测定10，11。胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种中也是保守的，强调了理解和研究异常胞嘧啶甲基化如何影响生物体发育轨迹的重要性11。此外，子宫内发育对母体暴露敏感，并有可能引起不良后果，例如直接表型后果、对成人疾病易感性的长期影响以及遗传表观遗传标记的跨代效应12，13，14。
长段的胞嘧啶-鸟嘌呤对或CpG岛一直是研究人员的主要焦点，旨在表征整个基因组中胞嘧啶甲基化的动力学15，16，17。基于亚硫酸氢盐的策略，如全基因组亚硫酸氢盐测序、减少代表性亚硫酸氢盐测序和亚硫酸氢盐扩增子测序，代表了在碱基对分辨率下询问胞嘧啶甲基化的金标准。然而，基于测序的方法成本高昂，因此无法监测各个发育阶段的胞嘧啶甲基化、每种化学物质的多种浓度以及每次治疗复制胚胎的能力。此外，基于测序的方法不能提供有关空间定位的信息，这对于了解发育中的胚胎中可能受影响的细胞类型和区域至关重要。同样，全球 DNA 甲基化测定，例如甲基化依赖性限制性分析、5-mC 酶联免疫测定 （ELISA） 和 5-甲基-2′-脱氧胞苷 （5-mC） 液相色谱-质谱 （LC-MS） 依赖于细胞或组织匀浆，因此，无法监测完整标本12，18 内胞嘧啶甲基化随空间和时间的定位和大小。
由于自动化 体内 成像、遗传操作、快速宫 外 发育时间和胚胎发生过程中的饲养易于，斑马鱼胚胎继续被广泛用作生理上完整的模型，以揭示异生素介导的途径，这些途径在早期胚胎发育期间导致不良结果。因此，使用市售的针对5-mC的抗体，以下方案描述了一种经济高效的策略，通过利用全卡口免疫组织化学（IHC）、自动高内涵成像和统计分析前使用编程语言的高效数据处理，对单个完整斑马鱼胚胎中的胞嘧啶甲基化进行快速有效的时空监测。
就目前所知，这种方法是第一个监测完整斑马鱼胚胎内5-mC的方法。该方法能够检测细胞团内的DNA甲基化，并且还能够在母体到合子过渡期间检测卵黄定位母体mRNA的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定在表观遗传重编程过程中有可能原 位 破坏胞嘧啶甲基化的化学物质。
Protocol
Representative Results
Discussion
在此协议中，有几个步骤至关重要。首先，在对胚胎进行去皮时，重要的是将针头指向远离胚胎/卵黄囊/细胞团的组织，因为发育中的胚胎的这些部分非常脆弱且易于刺穿。其次，将标记的胚胎转移到单个孔中时，请使用玻璃移液管转移胚胎，因为它们会粘附在塑料移液器上。第三，在进行整体安装IHC时，请确保板免受光照。最后，在完成全安装IHC方案后，在成像前让板在4°C的1x PBS中孵育过夜，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究支持由 UCR 研究生部奖学金提供给 SAB、NRSA T32 培训计划奖学金 （T32ES018827） 提供给 SAB 以及美国国立卫生研究院赠款 （R01ES027576） 和美国农业部国家粮食和农业研究所孵化项目 （1009609） 提供给 DCV。
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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