Быстрый и эффективный пространственно-временный мониторинг нормального и аберрантного метилирования цитозина в интактных эмбрионах рыбок данио
Summary
В этой статье описывается протокол быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга нормального и аберрантного метилирования цитозина в интактных эмбрионах рыбок данио.
Abstract
Метилирование цитозина высоко сохраняется у всех видов позвоночных и, как ключевой фактор эпигенетического программирования и состояния хроматина, играет решающую роль в раннем эмбриональном развитии. Ферментативные модификации приводят к активному метилированию и деметилированию цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующему окислению 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин. Эпигенетическое перепрограммирование является критическим периодом внутриутробного развития, и материнское воздействие химических веществ может перепрограммировать эпигеном в потомстве. Это может потенциально вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты наследственных эпигенетических меток. Хотя секвенирование на основе бисульфита позволяет исследователям опрашивать метилирование цитозина с разрешением пары оснований, подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают использоваться в качестве физиологически неповрежденной модели для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Поэтому, используя коммерчески доступные 5-мС-специфические антитела, мы описываем экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием цельной иммуногистохимии, автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа. Согласно современным знаниям, этот метод является первым, который успешно обнаруживает и количественно оценивает уровни 5-mC in situ в эмбрионах рыбок данио во время раннего развития. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.
Introduction
Ферментативные модификации стимулируют активное метилирование и деметилирование цитозина в 5-метилцитозин (5-мС) и последующее окисление 5-мС в 5-гидроксиметилцитозин, 5-формилцитозин и 5-карбоксильцитозин 1,2. Трис(1,3-дихлор-2-пропил) фосфат (TDCIPP) является широко используемым антипиреном в Соединенных Штатах, который, как было ранее продемонстрировано, изменяет траекторию метилирования цитозина после раннего эмбрионального воздействия от 0,75 часа после оплодотворения (HPF) до ранней гаструляции (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . У позвоночных 5-мС и его модифицированные производные имеют решающее значение для регулирования раннего эмбрионального развития9. Оплодотворение эмбриона вызывает деметилирование родительской ДНК, за которым следует деградация материнской мРНК, активация зиготического генома и реметилирование зиготического генома9. Биологически значимые процессы, использующие метилирование цитозина, включают модификацию гистонов, рекрутирование транскрипционного механизма, метилирование РНК, эпигенетическое перепрограммирование и определение структуры хроматина10,11. Метилирование цитозина также сохраняется среди видов позвоночных, подчеркивая важность понимания и изучения того, как аберрантное метилирование цитозина может влиять на траекторию развития организма11. Кроме того, внутриутробное развитие чувствительно к материнскому воздействию и может вызвать неблагоприятные исходы, такие как немедленные фенотипические последствия, долгосрочные последствия для восприимчивости к заболеваниям у взрослых и трансгенерационные эффекты унаследованных эпигенетических меток 12,13,14.
Длинные участки пар цитозин-гуанин, или острова CpG, были основными очагами исследователей, которые стремятся охарактеризовать динамику метилирования цитозина в геноме 15,16,17. Стратегии, основанные на бисульфите, такие как секвенирование бисульфита всего генома, секвенирование бисульфита с пониженным представлением и секвенирование бисульфитного ампликона, представляют собой золотой стандарт для опроса метилирования цитозина при разрешении пары оснований. Однако подходы, основанные на секвенировании, являются непомерно дорогостоящими и, как таковые, исключают возможность мониторинга метилирования цитозина на разных стадиях развития, множественных концентраций на химическое вещество и репликации эмбрионов за обработку. Кроме того, подходы, основанные на секвенировании, не предоставляют информацию о пространственной локализации, что имеет решающее значение для понимания потенциально затронутых типов клеток и областей в развивающемся эмбрионе. Аналогичным образом, глобальные анализы метилирования ДНК, такие как метилирующий зависимый рестрикционный анализ, иммунологические анализы 5-мС (ИФА) и 5-метил-2′-дезоксицитидин (5-мС) жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS), полагаются на гомогенаты клеток или тканей и, как таковые, исключают возможность мониторинга локализации и величины метилирования цитозина в пространстве и времени в неповрежденных образцах12,18.
Благодаря простоте автоматизированной визуализации in vivo , генетическим манипуляциям, быстрому времени развития ex utero и животноводству во время эмбриогенеза, эмбрионы рыбок данио продолжают широко использоваться в качестве физиологически неповрежденных моделей для выявления ксенобиотически-опосредованных путей, которые способствуют неблагоприятным исходам во время раннего эмбрионального развития. Таким образом, используя коммерчески доступные антитела, специфичные для 5-mC, приведенный ниже протокол описывает экономически эффективную стратегию быстрого и эффективного пространственно-временного мониторинга метилирования цитозина в отдельных, интактных эмбрионах рыбок данио с использованием иммуногистохимии (IHC), автоматизированной визуализации с высоким содержанием и эффективной обработки данных с использованием языка программирования до статистического анализа.
Согласно современным знаниям, этот метод является первым для мониторинга 5-mC в интактных эмбрионах рыбок данио. Метод позволяет обнаруживать метилирование ДНК в клеточной массе, а также обладает способностью обнаруживать метилирование цитозина локализованных желтком материнских мРНК во время перехода от матери к зиготе. В целом, этот метод будет полезен для быстрой идентификации химических веществ, которые могут нарушить метилирование цитозина in situ во время эпигенетического перепрограммирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время этого протокола есть несколько шагов, которые являются критическими. Во-первых, при дехорионации эмбрионов важно направить иглу в сторону от ткани эмбриона/желточного мешка/клеточной массы, так как эти участки развивающегося эмбриона очень хрупкие и легко прокалываются. Во-вт…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследовательская поддержка была предоставлена стипендией UCR Graduate Division Fellowship для SAB, стипендией учебной программы NRSA T32 (T32ES018827) для SAB и грантом Национальных институтов здравоохранения (R01ES027576) и проектом Национального института пищевых продуктов и сельского хозяйства США (1009609) для DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
