Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo’s.
Abstract
Cytosinemethylatie is sterk geconserveerd bij gewervelde soorten en speelt, als een belangrijke aanjager van epigenetische programmering en chromatinetoestand, een cruciale rol in de vroege embryonale ontwikkeling. Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine. Epigenetische herprogrammering is een kritieke periode tijdens de ontwikkeling van de baarmoeder en maternale blootstelling aan chemicaliën heeft het potentieel om het epigenoom in nakomelingen te herprogrammeren. Dit kan mogelijk nadelige gevolgen veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken. Hoewel op bisulfiet gebaseerde sequencing onderzoekers in staat stelt om cytosinemethylatie met basenpaarresolutie te ondervragen, zijn op sequencing gebaseerde benaderingen onbetaalbaar en sluiten ze als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo’s per behandeling te repliceren. Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, blijven zebravisembryo’s worden gebruikt als een fysiologisch intact model voor het blootleggen van xenobiotisch gemedieerde routes die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijven we, met behulp van commercieel beschikbare 5-mC-specifieke antilichamen, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie binnen individuele, intacte zebravisembryo’s door gebruik te maken van immunohistochemie met hele mount, geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse. Volgens de huidige kennis is deze methode de eerste die met succes 5-mC-niveaus in situ in zebravisembryo’s detecteert en kwantificeert tijdens de vroege ontwikkeling. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA’s te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.
Introduction
Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloor-2-propyl)fosfaat (TDCIPP) is een veelgebruikte vlamvertrager in de Verenigde Staten waarvan eerder is aangetoond dat het het traject van cytosinemethylatie verandert na vroege embryonale blootstelling vanaf 0,75 uur na de bevruchting (hpf) door vroege gastrulatie (6 pkf)3,4,5,6,7,8 . Binnen gewervelde dieren zijn 5-mC en zijn gemodificeerde derivaten van cruciaal belang voor het reguleren van de vroege embryonale ontwikkeling9. Bevruchting van een embryo veroorzaakt demethylatie van ouderlijk DNA, gevolgd door maternale mRNA-afbraak, zygotische genoomactivering en remethylering van het zygotische genoom9. Biologisch relevante processen die cytosinemethylatie gebruiken, omvatten histonmodificatie, rekrutering van transcriptionele machines, RNA-methylatie, epigenetische herprogrammering en bepaling van chromatinestructuur10,11. Cytosinemethylatie wordt ook bewaard bij gewervelde soorten, wat het belang onderstreept van het begrijpen en onderzoeken van hoe afwijkende cytosinemethylatie het traject van de ontwikkeling van een organisme kan beïnvloeden11. Bovendien is de ontwikkeling in utero gevoelig voor maternale blootstelling en kan het nadelige uitkomsten veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken 12,13,14.
Lange stukken cytosine-guanineparen, of CpG-eilanden, zijn de primaire foci van onderzoekers geweest die tot doel hebben de dynamiek van cytosinemethylatie in het genoom te karakteriseren 15,16,17. Op bisulfiet gebaseerde strategieën zoals bisulfietsequencing van het hele genoom, bisulfietsequencing met verminderde representatie en bisulfiet ampliconsequencing vertegenwoordigen de gouden standaard voor het ondervragen van cytosinemethylatie bij basenpaarresolutie. Op sequencing gebaseerde benaderingen zijn echter onbetaalbaar en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo’s per behandeling te repliceren. Bovendien bieden op sequencing gebaseerde benaderingen geen informatie over ruimtelijke lokalisatie, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van mogelijk aangetaste celtypen en gebieden binnen een zich ontwikkelend embryo. Evenzo vertrouwen globale DNA-methylatietests zoals methylatieafhankelijke restrictieanalyse, 5-mC enzymgebonden immunoassays (ELISA’s) en 5-methyl-2′-deoxycytidine (5-mC) vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op cel- of weefselhomogenaten en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om de lokalisatie en omvang van cytosinemethylatie over ruimte en tijd in intacte monsters te controleren12,18.
Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, worden zebravisembryo’s nog steeds op grote schaal gebruikt als fysiologisch intacte modellen om xenobiotisch gemedieerde routes te ontdekken die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijft het onderstaande protocol, met behulp van commercieel beschikbare antilichamen die specifiek zijn voor 5-mC, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie in individuele, intacte zebravisembryo’s door gebruik te maken van whole-mount immunohistochemie (IHC), geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse.
Voor zover bekend is deze methode de eerste die 5-mC monitort binnen intacte zebravisembryo’s. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA’s te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens dit protocol zijn er een paar stappen die van cruciaal belang zijn. Ten eerste is het bij het dechorioneren van embryo’s belangrijk om de naald weg te wijzen van het weefsel van de embryo/ dooierzak / celmassa, omdat deze delen van het zich ontwikkelende embryo zeer kwetsbaar en gemakkelijk te doorboren zijn. Ten tweede, bij het overbrengen van gelabelde embryo’s naar individuele putten, gebruik dan een glazen pipet om embryo’s over te brengen, omdat ze zich hechten aan een plastic pipet. Ten derde, bij het uitvo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoeksondersteuning werd geleverd door een UCR Graduate Division Fellowship aan SAB, een NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) aan SAB en een National Institutes of Health-beurs (R01ES027576) en USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) aan DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
