Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi
Summary
Bu yazıda, bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli spatiotemporal izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında oldukça korunmuştur ve epigenetik programlama ve kromatin durumunun önemli bir itici gücü olarak, erken embriyonik gelişimde kritik bir rol oynar. Enzimatik modifikasyonlar, aktif metilasyonunu ve sitozinin 5-metilsitozine (5-mC) demetilasyonunu ve ardından 5-mC’nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilyosin içine oksidasyonunu yönlendirir. Epigenetik yeniden programlama, in utero gelişim sırasında kritik bir dönemdir ve annenin kimyasallara maruz kalması, yavrulardaki epigenomu yeniden programlama potansiyeline sahiptir. Bu potansiyel olarak acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olabilir. Bisülfit bazlı dizileme, araştırmacıların baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamasına izin vermesine rağmen, dizileme tabanlı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalar boyunca sitozin metilasyonunu izleme yeteneğini, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında yetiştiriciliğin kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolakları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış bir model olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, ticari olarak temin edilebilen 5-mC’ye özgü antikorları kullanarak, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütüne monte immünohistokimya, otomatik yüksek içerikli görüntüleme ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir strateji açıklıyoruz. Mevcut bilgilere göre, bu yöntem, erken gelişim sırasında zebra balığı embriyolarında 5-mC seviyelerini yerinde olarak başarılı bir şekilde tespit eden ve ölçen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA’ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.
Introduction
Enzimatik modifikasyonlar, sitozinin aktif metilasyonunu ve demetilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) içine ve ardından 5-mC’nin 5-hidroksimetilsitozin, 5-formilsitozin ve 5-karboksilsitozin 1,2’ye oksidasyonunu yönlendirir. Tris (1,3-dikloro-2-propil) fosfat (TDCIPP), Amerika Birleşik Devletleri’nde yaygın olarak kullanılan ve daha önce döllenme sonrası 0.75 saat sonra (hpf) erken gastrulasyona (6 hpf) kadar erken embriyonik maruziyeti takiben sitozin metilasyonunun yörüngesini değiştirdiği daha önce kanıtlanmış bir alev geciktiricidir 3,4,5,6,7,8 . Omurgalılarda, 5-mC ve modifiye edilmiş türevleri, erken embriyonik gelişimi düzenlemek için kritik öneme sahiptir9. Bir embriyonun döllenmesi, ebeveyn DNA’sının demetilasyonunu tetikler, bunu maternal mRNA bozunması, zigotik genom aktivasyonu ve zigotik genomun remetilasyonuizler 9. Sitozin metilasyonunu kullanan biyolojik olarak ilgili süreçler arasında histon modifikasyonu, transkripsiyonel makinelerin işe alınması, RNA metilasyonu, epigenetik yeniden programlama ve kromatin yapısının belirlenmesi10,11 sayılabilir. Sitozin metilasyonu, omurgalı türleri arasında da korunmaktadır ve anormal sitozin metilasyonunun bir organizmanın gelişiminin yörüngesini nasıl etkileyebileceğini anlamanın ve araştırmanın önemini vurgulamaktadır11. Ayrıca, in utero gelişim maternal maruziyete duyarlıdır ve acil fenotipik sonuçlar, yetişkin hastalık duyarlılığı üzerinde uzun vadeli etkiler ve kalıtsal epigenetik işaretlerin nesiller arası etkileri gibi olumsuz sonuçlara neden olma potansiyeline sahiptir12,13,14.
Sitozin-guanin çiftlerinin veya CpG adalarının uzun uzantıları, genom15,16,17 boyunca sitozin metilasyonunun dinamiklerini karakterize etmeyi amaçlayan araştırmacıların birincil odakları olmuştur. Tüm genom bisülfit dizilimi, azaltılmış temsili bisülfit dizilimi ve bisülfit amplikon dizilimi gibi bisülfit bazlı stratejiler, baz çifti çözünürlüğünde sitozin metilasyonunu sorgulamak için altın standardı temsil eder. Bununla birlikte, dizilemeye dayalı yaklaşımlar maliyet engelleyicidir ve bu nedenle, gelişimsel aşamalarda sitozin metilasyonunu, kimyasal başına çoklu konsantrasyonları izleme ve tedavi başına embriyoları çoğaltma yeteneğini engeller. Ek olarak, dizileme tabanlı yaklaşımlar, gelişmekte olan bir embriyo içindeki potansiyel olarak etkilenen hücre tiplerini ve alanlarını anlamak için kritik olan mekansal lokalizasyon hakkında bilgi sağlamaz. Benzer şekilde, metilasyona bağımlı kısıtlama analizi, 5-mC enzime bağlı immünotahliller (ELISA’lar) ve 5-metil-2′-deoksisitidin (5-mC) sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) gibi küresel DNA metilasyon testleri, hücre veya doku homojenatlarına dayanır ve bu nedenle, bozulmamış örnekler12,18 içinde sitozin metilasyonunun uzay ve zaman üzerindeki lokalizasyonunu ve büyüklüğünü izleme yeteneğini engeller.
Otomatik in vivo görüntüleme, genetik manipülasyonlar, hızlı ex utero gelişim süresi ve embriyogenez sırasında hayvancılığın kolaylığı nedeniyle, zebra balığı embriyoları, erken embriyonik gelişim sırasında olumsuz sonuçlara katkıda bulunan ksenobiyotik aracılı yolları ortaya çıkarmak için fizyolojik olarak bozulmamış modeller olarak yaygın olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu nedenle, 5-mC’ye özgü ticari olarak temin edilebilen antikorları kullanarak, aşağıdaki protokol, istatistiksel analizden önce programlama dilini kullanarak bütün-monte immünohistokimyadan (IHC), otomatik yüksek içerikli görüntülemeden ve verimli veri işlemeden yararlanarak bireysel, bozulmamış zebra balığı embriyolarında sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli bir şekilde mekansal zamansal izlenmesi için uygun maliyetli bir stratejiyi açıklamaktadır.
Mevcut bilgilere göre, bu yöntem bozulmamış zebra balığı embriyolarında 5-mC’yi izleyen ilk yöntemdir. Yöntem, hücre kütlesi içindeki DNA metilasyonunun tespit edilmesini sağlar ve ayrıca maternal-zigotik geçiş sırasında yumurta sarısı lokalize maternal mRNA’ların sitozin metilasyonunu tespit etme yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yöntem, epigenetik yeniden programlama sırasında sitozin metilasyonunu in situ olarak bozma potansiyeline sahip kimyasalların hızlı bir şekilde tanımlanması için yararlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol sırasında, kritik olan birkaç adım vardır. İlk olarak, embriyoları dekoryonize ederken, gelişmekte olan embriyonun bu kısımları çok kırılgan ve delinmesi kolay olduğundan, iğneyi embriyo / yumurta sarısı kesesi / hücre kütlesinin dokusundan uzağa yönlendirmek önemlidir. İkincisi, etiketli embriyoları bireysel kuyucuklara aktarırken, plastik bir pipete yapışacakları için embriyoları transfer etmek için bir cam pipet kullanın. Üçüncüsü, tam montajlı IHC yaparken, plakanın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma desteği, SAB’a UCR Lisansüstü Bölüm Bursu, SAB’a NRSA T32 Eğitim Programı Bursu (T32ES018827) ve DCV’ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi (R01ES027576) ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü Hatch Projesi (1009609) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
