Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra
Summary
Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.
Abstract
A metilação da citosina é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados e, como um dos principais impulsionadores da programação epigenética e do estado de cromatina, desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário inicial. As modificações enzimáticas impulsionam a metilação ativa e a desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina. A reprogramação epigenética é um período crítico durante o desenvolvimento no útero , e a exposição materna a produtos químicos tem o potencial de reprogramar o epigenoma dentro da prole. Isso pode potencialmente causar resultados adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença em adultos e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias. Embora o sequenciamento baseado em bissulfito permita que os pesquisadores questionem a metilação da citosina na resolução do par de bases, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina nos estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser usados como um modelo fisiologicamente intacto para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos específicos de 5 mC comercialmente disponíveis, descrevemos uma estratégia econômica para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística. Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a detectar e quantificar com sucesso os níveis de 5 mC in situ dentro de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.
Introduction
As modificações enzimáticas conduzem à metilação ativa e à desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina 1,2. O fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) é um retardador de chama amplamente utilizado nos Estados Unidos que já demonstrou alterar a trajetória de metilação da citosina após exposição embrionária precoce de 0,75 horas pós-fertilização (hpf) até gastrulação precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro dos vertebrados, o 5-mC e seus derivados modificados são críticos para regular o desenvolvimento embrionário precoce9. A fertilização de um embrião desencadeia a desmetilação do DNA parental, seguida pela degradação do mRNA materno, ativação do genoma zigótico e remetilação do genoma zigótico9. Processos biologicamente relevantes que utilizam metilação de citosina incluem modificação de histonas, recrutamento de maquinário transcricional, metilação de RNA, reprogramação epigenética e determinação da estrutura da cromatina10,11. A metilação da citosina também é conservada entre as espécies de vertebrados, ressaltando a importância de compreender e investigar como a metilação aberrante da citosina pode afetar a trajetória do desenvolvimento de um organismo11. Além disso, o desenvolvimento in utero é sensível à exposição materna e tem o potencial de causar desfechos adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença do adulto e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias12,13,14.
Longos trechos de pares citosina-guanina, ou ilhas CpG, têm sido os focos primários de pesquisadores que visam caracterizar a dinâmica da metilação da citosina em todo o genoma15,16,17. Estratégias baseadas em bissulfito, como sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de amplificador de bissulfito representam o padrão-ouro para interrogar a metilação da citosina na resolução do par de bases. No entanto, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina em estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Além disso, as abordagens baseadas em sequenciamento não fornecem informações sobre localização espacial, o que é crítico para a compreensão de tipos de células e áreas potencialmente afetadas dentro de um embrião em desenvolvimento. Da mesma forma, ensaios globais de metilação do DNA, como análise de restrição dependente de metilação, imunoensaios enzimáticos (ELISAs) de 5-mC e cromatografia líquida-massa (LC-MS) de 5-metil-2′-desoxicitidina (5-mC) dependem de homogeneizados celulares ou teciduais e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a localização e a magnitude da metilação da citosina no espaço e no tempo dentro de espécimes intactos12,18.
Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser amplamente utilizados como modelos fisiologicamente intactos para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos comercialmente disponíveis específicos para 5 mC, o protocolo abaixo descreve uma estratégia econômica para monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica (IHC) de montagem completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística.
Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a monitorar 5-mC dentro de embriões intactos de peixe-zebra. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante este protocolo, existem algumas etapas que são críticas. Primeiro, ao descorionar embriões, é importante apontar a agulha para longe do tecido do embrião / saco vitelino / massa celular, pois essas porções do embrião em desenvolvimento são muito frágeis e fáceis de perfurar. Em segundo lugar, ao transferir embriões marcados para poços individuais, use uma pipeta de vidro para transferir embriões, pois eles aderirão a uma pipeta de plástico. Em terceiro lugar, ao executar IHC de montagem completa, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio à pesquisa foi fornecido por uma bolsa da Divisão de Pós-Graduação da UCR para a SAB, uma bolsa do Programa de Treinamento NRSA T32 (T32ES018827) para a SAB e uma bolsa do National Institutes of Health (R01ES027576) e o USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) para a DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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