Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.
Abstract
Die Cytosinmethylierung ist bei Wirbeltierarten hoch konserviert und spielt als Schlüsselfaktor für epigenetische Programmierung und Chromatinzustand eine entscheidende Rolle in der frühen Embryonalentwicklung. Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin voran. Epigenetische Reprogrammierung ist eine kritische Phase während der utero-Entwicklung , und die mütterliche Exposition gegenüber Chemikalien hat das Potenzial, das Epigenom innerhalb der Nachkommen neu zu programmieren. Dies kann möglicherweise zu nachteiligen Ergebnissen wie unmittelbaren phänotypischen Folgen, langfristigen Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationalen Auswirkungen vererbter epigenetischer Markierungen führen. Obwohl die Bisulfit-basierte Sequenzierung es Forschern ermöglicht, die Cytosinmethylierung mit Basenpaarauflösung abzufragen, sind sequenzierungsbasierte Ansätze unerschwinglich und schließen daher die Fähigkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Aufgrund der Leichtigkeit der automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin als physiologisch intaktes Modell zur Aufdeckung von xenobiotisch vermittelten Signalwegen verwendet, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen embryonalen Entwicklung beitragen. Daher beschreiben wir unter Verwendung kommerziell verfügbarer 5-mC-spezifischer Antikörper eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie, automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse. Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die erfolgreich 5-mC-Spiegel in situ in Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung nachweist und quantifiziert. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.
Introduction
Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin 1,2 voran. Tris(1,3-dichlor-2-propyl) phosphat (TDCIPP) ist ein in den Vereinigten Staaten weit verbreitetes Flammschutzmittel, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf der Cytosinmethylierung nach früher embryonaler Exposition von 0,75 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis zur frühen Gastrulation (6 hpf) verändert3,4,5,6,7,8 . Bei Wirbeltieren sind 5-mC und seine modifizierten Derivate entscheidend für die Regulierung der frühen Embryonalentwicklung9. Die Befruchtung eines Embryos löst die Demethylierung der elterlichen DNA aus, gefolgt vom mütterlichen mRNA-Abbau, der Aktivierung des zygotischen Genoms und der Remethylierung des zygotischen Genoms9. Zu den biologisch relevanten Prozessen, die die Cytosinmethylierung nutzen, gehören die Histonmodifikation, die Rekrutierung von Transkriptionsmaschinen, die RNA-Methylierung, die epigenetische Reprogrammierung und die Bestimmung der Chromatinstruktur10,11. Die Cytosinmethylierung ist auch bei Wirbeltierarten konserviert, was unterstreicht, wie wichtig es ist, zu verstehen und zu untersuchen, wie aberrante Cytosinmethylierung den Entwicklungsverlauf eines Organismus beeinflussen kann11. Darüber hinaus reagiert die Entwicklung in utero empfindlich auf mütterliche Exposition und hat das Potenzial, nachteilige Ergebnisse wie unmittelbare phänotypische Folgen, langfristige Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationale Effekte von vererbten epigenetischen Markierungen zu verursachen12,13,14.
Lange Strecken von Cytosin-Guanin-Paaren oder CpG-Inseln waren die primären Schwerpunkte von Forschern, die darauf abzielen, die Dynamik der Cytosinmethylierung über das Genom 15,16,17 zu charakterisieren. Bisulfit-basierte Strategien wie die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms, die Bisulfitsequenzierung mit reduzierter Repräsentation und die Bisulfitamplikonsequenzierung stellen den Goldstandard für die Abfrage der Cytosinmethylierung bei Basenpaarauflösung dar. Sequenzierungsbasierte Ansätze sind jedoch unerschwinglich und schließen daher die Möglichkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Darüber hinaus liefern sequenzierungsbasierte Ansätze keine Informationen über die räumliche Lokalisation, die für das Verständnis potenziell betroffener Zelltypen und -bereiche innerhalb eines sich entwickelnden Embryos entscheidend ist. In ähnlicher Weise beruhen globale DNA-Methylierungsassays wie die methylierungsabhängige Restriktionsanalyse, 5-mC-Enzym-verknüpfte Immunoassays (ELISAs) und die 5-Methyl-2′-Desoxycytidin-(5-mC)-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf Zell- oder Gewebehomogenaten und schließen daher die Fähigkeit aus, die Lokalisation und das Ausmaß der Cytosinmethylierung über Raum und Zeit innerhalb intakter Proben zu überwachen12,18.
Aufgrund der einfachen automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin häufig als physiologisch intakte Modelle verwendet, um xenobiotisch vermittelte Signalwege aufzudecken, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen Embryonalentwicklung beitragen. Daher beschreibt das folgende Protokoll unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper, die spezifisch für 5-mC sind, eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie (IHC), automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse.
Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die 5-mC in intakten Zebrafischembryonen überwacht. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während dieses Protokolls gibt es einige Schritte, die kritisch sind. Erstens ist es bei der Dechorionierung von Embryonen wichtig, die Nadel vom Gewebe des Embryos / Dottersacks / der Zellmasse wegzuzeigen, da diese Teile des sich entwickelnden Embryos sehr zerbrechlich und leicht zu durchstechen sind. Zweitens, wenn Sie markierte Embryonen in einzelne Vertiefungen übertragen, verwenden Sie eine Glaspipette, um Embryonen zu übertragen, da sie an einer Kunststoffpipette haften. Drittens ist bei der Durchführung von I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschungsunterstützung wurde durch ein UCR Graduate Division Fellowship für SAB, ein NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) für SAB und ein National Institutes of Health Stipendium (R01ES027576) und USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) für DCV bereitgestellt.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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