온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링
Summary
이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
시토신 메틸화는 척추동물 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 후성유전학적 프로그래밍과 염색질 상태의 핵심 동인으로서 초기 배아 발달에 중요한 역할을 합니다. 효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 이후 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신으로 산화시킵니다. 후성유전학적 재프로그래밍은 자궁 발달 중 중요한 시기이며, 산모가 화학 물질에 노출되면 자손 내에서 후성유전체를 재프로그래밍할 가능성이 있습니다. 이것은 잠재적으로 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 마크의 세대 간 효과와 같은 불리한 결과를 유발할 수 있습니다. 중아황산염 기반 시퀀싱을 통해 연구자는 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사할 수 있지만 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 자동화된 생체 내 이미징, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 사육의 용이성으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이생물 매개 경로를 밝히기 위한 생리학적으로 온전한 모델로 계속 사용됩니다. 따라서 상용 5-mC 특이적 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학, 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다. 현재 지식에 따르면, 이 방법은 초기 발달 동안 제브라피쉬 배아 내에서 in situ 5-mC 수준을 성공적으로 검출하고 정량화한 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.
Introduction
효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 후속 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신 1,2로 산화시킵니다. 트리스 (1,3- 디클로로 -2- 프로필) 포스페이트 (TDCIPP)는 미국에서 널리 사용되는 난연제로, 수정 후 0.75 시간 (HPF)에서 조기 위장 (6 hpf)까지 초기 배아 노출 후 시토신 메틸화의 궤적을 변경하는 것으로 이전에 입증되었습니다.3,4,5,6,7,8 . 척추동물 내에서 5-mC와 그 변형된 유도체는 초기 배아 발달을 조절하는 데 중요합니다9. 배아의 수정은 부모 DNA의 탈메틸화를 유발하고, 모체 mRNA 분해, 접합체 게놈 활성화 및 접합체게놈의 재메틸화를 유발합니다9. 시토신 메틸화를 활용하는 생물학적으로 관련된 과정에는 히스톤 변형, 전사 기계의 모집, RNA 메틸화, 후성유전학적 재프로그래밍 및 염색질 구조10,11의 결정이 포함됩니다. 시토신 메틸화는 또한 척추동물 종들 사이에서 보존되며, 비정상적인 시토신 메틸화가 유기체의 발달 궤적에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하고 조사하는 것의 중요성을 강조합니다11. 또한, 자궁 내 발달은 산모의 노출에 민감하며 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 표시의 세대 간 영향과 같은 불리한 결과를 초래할 가능성이 있습니다12,13,14.
시토신-구아닌 쌍 또는 CpG 섬의 긴 스트레칭은 게놈15,16,17에 걸친 시토신 메틸화의 역학을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자의 주요 초점이었습니다. 전체 게놈 중아황산염 시퀀싱, 감소된 표현 중아황산염 시퀀싱 및 중아황산염 앰플리콘 시퀀싱과 같은 중아황산염 기반 전략은 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사하기 위한 황금 표준을 나타냅니다. 그러나 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 또한 시퀀싱 기반 접근 방식은 공간 국소화에 대한 정보를 제공하지 않으며, 이는 잠재적으로 영향을 받는 세포 유형 및 발달 중인 배아 내 영역을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 메틸화 의존적 제한 분석, 5-mC 효소 결합 면역 분석법 (ELISAs) 및 5-메틸-2′-데옥시시티딘 (5-mC) 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)과 같은 글로벌 DNA 메틸화 분석은 세포 또는 조직 균질물에 의존하며, 따라서 손상되지 않은 표본12,18 내에서 공간 및 시간에 따른 시토신 메틸화의 국소화 및 크기를 모니터링하는 능력을 배제합니다.
자동화된 생체 내 이미징의 용이성, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 축산으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이물질적 매개 경로를 밝히기 위해 생리학적으로 온전한 모델로 계속 널리 사용되고 있습니다. 따라서 아래 프로토콜은 5-mC에 특이적인 시판되는 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학(IHC), 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다.
현재 지식에 따르면,이 방법은 손상되지 않은 제브라 피쉬 배아 내에서 5-mC를 모니터링하는 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 중에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배아를 제거 할 때 발달중인 배아의 이러한 부분은 매우 연약하고 구멍을 뚫기 쉽기 때문에 배아 / 난황낭 / 세포 덩어리의 조직에서 바늘을 멀리 향하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 라벨이 붙은 배아를 개별 웰로 옮길 때 유리 피펫을 사용하여 배아가 플라스틱 피펫에 부착되므로 배아를 옮깁니다. 셋째, 전체 장착 IHC를 수행할 때 플레?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 지원은 SAB에 UCR 대학원 부문 펠로우십, SAB에 NRSA T32 교육 프로그램 펠로우십(T32ES018827), DCV에 국립 보건원 보조금(R01ES027576) 및 USDA 국립 식량 농업 연구소 해치 프로젝트(1009609)에서 제공되었습니다.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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