Hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner
Summary
Dette papir beskriver en protokol for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner.
Abstract
Cytosinmethylering er stærkt bevaret på tværs af hvirveldyrarter og spiller som en vigtig drivkraft for epigenetisk programmering og kromatintilstand en kritisk rolle i tidlig embryonal udvikling. Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero-udvikling , og moderens eksponering for kemikalier har potentialet til at omprogrammere epigenomet inden for afkom. Dette kan potentielt forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsfølsomhed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker. Selvom bisulfitbaseret sekventering gør det muligt for efterforskere at forhøre cytosinmethylering ved baseparopløsning, er sekventeringsbaserede tilgange omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan evnen til at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. Behandling. På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat som en fysiologisk intakt model til afdækning af xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver vi ved hjælp af kommercielt tilgængelige 5-mC-specifikke antistoffer en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi, automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse. Ifølge den nuværende viden er denne metode den første, der med succes detekterer og kvantificerer 5-mC-niveauer in situ i zebrafiskembryoner under tidlig udvikling. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA’er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Introduction
Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin 1,2. Tris(1,3-dichlor-2-propyl)phosphat (TDCIPP) er et meget anvendt flammehæmmende middel i USA, der tidligere har vist sig at ændre cytosinmethyleringens bane efter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer efter befrugtning (hpf) gennem tidlig gastrulation (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Inden for hvirveldyr er 5 mC og dets modificerede derivater afgørende for regulering af tidlig embryonal udvikling9. Befrugtning af et embryo udløser demethylering af forældrenes DNA efterfulgt af moderens mRNA-nedbrydning, zygotisk genomaktivering og remethylering af det zygotiske genom9. Biologisk relevante processer, der anvender cytosinmethylering, omfatter histonmodifikation, rekruttering af transkriptionsmaskiner, RNA-methylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse af kromatinstruktur10,11. Cytosinmethylering bevares også blandt hvirveldyrarter, hvilket understreger vigtigheden af at forstå og undersøge, hvordan afvigende cytosinmethylering kan påvirke banen for en organismes udvikling11. Desuden er udviklingen i utero følsom over for moderens eksponering og har potentiale til at forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsmodtagelighed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker12,13,14.
Lange strækninger af cytosin-guaninpar eller CpG-øer har været de primære fokus for efterforskere, der sigter mod at karakterisere dynamikken i cytosinmethylering på tværs af genomet15,16,17. Bisulfitbaserede strategier såsom helgenombisulfitsekventering, reduceret repræsentation af bisulfitsekventering og bisulfitamplicon-sekventering repræsenterer guldstandarden til forhør af cytosinmethylering ved baseparopløsning. Sekventering baseret på metoder er imidlertid omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan muligheden for at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. behandling. Derudover giver sekventeringsbaserede tilgange ikke information om rumlig lokalisering, hvilket er afgørende for at forstå potentielt berørte celletyper og områder inden for et embryo, der udvikler sig. Tilsvarende er globale DNA-methyleringsassays såsom methyleringsafhængig restriktionsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISA’er) og 5-methyl-2′-deoxycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) afhængige af celle- eller vævshomogenater og udelukker som sådan evnen til at overvåge lokaliseringen og størrelsen af cytosinmethylering over rum og tid inden for intakte prøver12,18.
På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat i vid udstrækning som fysiologisk intakte modeller til at afdække xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver nedenstående protokol ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer, der er specifikke for 5 mC, en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi (IHC), automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse.
Efter den nuværende viden er denne metode den første til at overvåge 5 mC inden for intakte zebrafiskembryoner. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA’er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under denne protokol er der et par trin, der er kritiske. For det første er det vigtigt at pege nålen væk fra embryonets/cellemassens væv, når embryonen afkobles/cellemassen afkobles, da disse dele af det udviklende embryo er meget skrøbelige og lette at punktere. For det andet, når du overfører mærkede embryoner til individuelle brønde, skal du bruge en glaspipette til at overføre embryoner, da de klæber til en plastpipette. For det tredje, når du udfører helmonteret IHC, skal du sikre dig, at pladen er be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsstøtte blev ydet af et UCR Graduate Division Fellowship til SAB, et NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) til SAB og et National Institutes of Health-tilskud (R01ES027576) og USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) til DCV.
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O’Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
