बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की त्वरित और कुशल स्थानिक निगरानी
Summary
यह पेपर बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Abstract
साइटोसिन मिथाइलेशन कशेरुक प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित है और, एपिजेनेटिक प्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन स्थिति के एक प्रमुख चालक के रूप में, प्रारंभिक भ्रूण के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन में करते हैं। एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग गर्भाशय के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण अवधि है, और रसायनों के मातृ संपर्क में संतानों के भीतर एपिजीनोम को पुन: प्रोग्राम करने की क्षमता होती है। यह संभावित रूप से प्रतिकूल परिणामों का कारण बन सकता है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक निशान के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव। यद्यपि बिसल्फाइट-आधारित अनुक्रमण जांचकर्ताओं को बेस-जोड़ी संकल्प पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ करने में सक्षम बनाता है, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और इस तरह, विकास चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं, प्रति रासायनिक कई सांद्रता, और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराते हैं। भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण का उपयोग ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5-एमसी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हम सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करते हैं। वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि प्रारंभिक विकास के दौरान ज़ेब्राफिश भ्रूण के भीतर सीटू में 5-एमसी स्तरों का सफलतापूर्वक पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।
Introduction
एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन 1,2 में करते हैं। ट्राइस (1,3-डाइक्लोरो-2-प्रोपाइल) फॉस्फेट (टीडीसीआईपीपी) संयुक्त राज्य अमेरिका में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला लौ रोधी है जिसे पहले प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन (6 एचपीएफ) 3,4,5,6,7,8 के माध्यम से 0.75 घंटे बाद निषेचन (एचपीएफ) से प्रारंभिक भ्रूण के संपर्क में आने के बाद साइटोसिन मिथाइलेशन के प्रक्षेपवक्र को बदलने के लिए प्रदर्शित किया गया है। . कशेरुकियों के भीतर, 5-एमसी और इसके संशोधित डेरिवेटिव प्रारंभिकभ्रूण के विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। भ्रूण के निषेचन से माता-पिता के डीएनए का डिमिथाइलेशन शुरू होता है, इसके बाद मातृ एमआरएनए क्षरण, युग्मनज जीनोम सक्रियण और युग्मनज जीनोम 9 का रीमिथाइलेशन होताहै। जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाएं जो साइटोसिन मिथाइलेशन का उपयोग करती हैं, उनमें हिस्टोन संशोधन, ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी की भर्ती, आरएनए मिथाइलेशन, एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन संरचना10,11 का निर्धारण शामिल है। साइटोसिन मिथाइलेशन को कशेरुक प्रजातियों के बीच भी संरक्षित किया जाता है, जो यह समझने और जांच करने के महत्व को रेखांकित करता है कि असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन किसी जीव के विकास के प्रक्षेपवक्र को कैसे प्रभावित कर सकताहै। इसके अलावा, गर्भाशय विकास में मातृ जोखिम के प्रति संवेदनशील होता है और इसमें प्रतिकूल परिणाम पैदा करने की क्षमता होती है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक अंक 12,13,14 के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव।
साइटोसिन-गुआनिन जोड़े, या सीपीजी द्वीपों के लंबे खंड, जांचकर्ताओं के प्राथमिक केंद्र रहे हैं जिनका उद्देश्य जीनोम 15,16,17 में साइटोसिन मिथाइलेशन की गतिशीलता को चिह्नित करना है। बिसल्फाइट-आधारित रणनीतियां जैसे कि पूरे जीनोम बाइसल्फाइट अनुक्रमण, कम प्रतिनिधित्व बाइसल्फाइट अनुक्रमण, और बिसल्फाइट एम्प्लिकॉन अनुक्रमण बेस-जोड़ी रिज़ॉल्यूशन पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ के लिए स्वर्ण मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और, इस तरह, विकास के चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने, प्रति रसायन कई सांद्रता और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराने की क्षमता को रोकते हैं। इसके अलावा, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण स्थानिक स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं, जो एक विकासशील भ्रूण के भीतर संभावित रूप से प्रभावित सेल प्रकारों और क्षेत्रों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, मिथाइलेशन-निर्भर प्रतिबंध विश्लेषण, 5-एमसी एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोएसे (ईएलआईएसए), और 5-मिथाइल-2′-डीऑक्सीसाइटिडीन (5-एमसी) तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) जैसे वैश्विक डीएनए मिथाइलेशन परख सेल या ऊतक होमोजेनेट्स पर भरोसा करते हैं और इस तरह, बरकरार नमूनोंके भीतर अंतरिक्ष और समय पर साइटोसिन मिथाइलेशन के स्थानीयकरण और परिमाण की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं।
भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण को व्यापक रूप से ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, 5-एमसी के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, नीचे दिया गया प्रोटोकॉल सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करता है।
वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर 5-एमसी की निगरानी करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के दौरान, कुछ कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, भ्रूण को विघटित करते समय, सुई को भ्रूण / जर्दी थैली / सेल द्रव्यमान के ऊतक से दूर इंगित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि विकासशील भ्रूण के ये हिस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसएबी को यूसीआर ग्रेजुएट डिवीजन फैलोशिप, एसएबी को एक एनआरएसए टी 32 प्रशिक्षण कार्यक्रम फैलोशिप (टी 32ईएस 018827), और डीसीवी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान (आर01ईएस027576) और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर हैच प्रोजेक्ट (1009609) द्वारा अनुसंधान सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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