Rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer.

Abstract

Cytosinmetylering er svært konservert på tvers av virveldyrarter, og som en nøkkeldriver for epigenetisk programmering og kromatintilstand spiller en kritisk rolle i tidlig embryonal utvikling. Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero utvikling, og mors eksponering for kjemikalier har potensial til å omprogrammere epigenomet i avkom. Dette kan potensielt forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker. Selv om bisulfittbasert sekvensering gjør det mulig for etterforskere å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning, er sekvenseringsbaserte tilnærminger kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli brukt som en fysiologisk intakt modell for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 5-mC-spesifikke antistoffer beskriver vi derfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi, automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse. Med dagens kunnskap er denne metoden den første som lykkes med å oppdage og kvantifisere 5 mC-nivåer in situ i sebrafiskembryoer under tidlig utvikling. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

Introduction

Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin ^1,2. Tris (1,3-diklor-2-propyl) fosfat (TDCIPP) er et mye brukt flammehemmende middel i USA som tidligere har vist seg å endre banen til cytosinmetylering etter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer etter befruktning (hpf) gjennom tidlig gastrulering (6 hkf) 3,4,5,6,7,8 . Innenfor virveldyr er 5 mC og dets modifiserte derivater avgjørende for å regulere tidlig embryonal utvikling⁹. Befruktning av et embryo utløser demetylering av foreldrenes DNA, etterfulgt av mors mRNA-nedbrytning, zygotisk genomaktivering og remetylering av det zygotiske genomet⁹. Biologisk relevante prosesser som benytter cytosinmetylering inkluderer histonmodifisering, rekruttering av transkripsjonsmaskiner, RNA-metylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse av kromatinstruktur^10,11. Cytosinmetylering er også bevart blant virveldyrarter, noe som understreker viktigheten av å forstå og undersøke hvordan avvikende cytosinmetylering kan påvirke banen til en organismes utvikling¹¹. Videre er in utero utvikling følsom for mors eksponering og har potensial til å forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker^12,13,14.

Lange strekninger av cytosin-guaninpar, eller CpG-øyer, har vært de primære fokusene til etterforskere som tar sikte på å karakterisere dynamikken i cytosinmetylering over genomet^15,16,17. Bisulfittbaserte strategier som helgenombisulfittsekvensering, redusert representasjonsbisulfittsekvensering og bisulfittamplikonsekvensering representerer gullstandarden for å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning. Sekvenseringsbaserte tilnærminger er imidlertid kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. I tillegg gir sekvenseringsbaserte tilnærminger ikke informasjon om romlig lokalisering, noe som er kritisk for å forstå potensielt berørte celletyper og områder i et utviklende embryo. På samme måte er globale DNA-metyleringsanalyser som metyleringsavhengig restriksjonsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISAs) og 5-metyl-2′-deoksycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) avhengige av celle- eller vevshomogenater og utelukker som sådan evnen til å overvåke lokaliseringen og størrelsen på cytosinmetylering over rom og tid innenfor intakte prøver^12,18.

På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli mye brukt som fysiologisk intakte modeller for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved bruk av kommersielt tilgjengelige antistoffer som er spesifikke for 5-mC, beskriver derfor protokollen nedenfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi (IHC), automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse.

Til dagens kunnskap er denne metoden den første som overvåker 5 mC i intakte sebrafiskembryoer. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

Protocol

Voksne oppdrettere ble håndtert og behandlet i samsvar med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkjent dyrebruksprotokoll (#20180063) ved University of California, Riverside. 1. Sebrafisk embryo samling og kjemisk eksponering Legg til oppdrettsfeller i tanken til tanker som inneholder seksuelt modne og reproduktivt levedyktige voksne mannlige og kvinnelige sebrafisk. Legg til minst tre feller per 6 L tank minst 12 timer før innsamling kl. ~ 9:0…

Representative Results

Det overordnede målet med denne protokollen er å avgjøre om en behandling påvirker den relative overfloden av 5 mC ved å vurdere det totale arealet og den relative intensiteten av fluorescens innenfor faste og merkede sebrafiskembryoer. Etter å ha fullført protokollen, kan et fluorescensstereomikroskop brukes til først å avgjøre om hele IHC var vellykket. Når merkede embryoer observeres under et FITC- eller GFP-filter, indikeres et positivt resultat av et positivt FITC-signal i embryoet, mens et negativt resul…

Discussion

I løpet av denne protokollen er det noen få trinn som er kritiske. For det første, når du dekorionerer embryoer, er det viktig å peke nålen bort fra vevet til embryoet / eggeplommesekken / cellemassen, da disse delene av det utviklende embryoet er svært skjøre og enkle å punktere. For det andre, når du overfører merkede embryoer til individuelle brønner, bruk en glasspipette for å overføre embryoer, da de vil feste seg til en plastpipette. For det tredje, når du utfører helmontert IHC, må du sørge for a…

Materials

1.5-mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	540225
10-µL glass microcapillary pipette	Fisher Scientific	211762B
100-mm plastic Petri dish	Fisher Scientific	08757100D
10x phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP399500
1-mL pipette	Fisher Scientific	13690032
250-mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	FB501250
5-mL pipette	Fisher Scientific	13690033
60-mm glass petri dishes with lids	Fisher Scientific	08747A
96-well plate	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody	Fisher Scientific	A21121
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
Hotplate	Fisher Scientific	1110016SH
In-tank breeding traps	Aquatic Habitats	N/A	This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System	Molecular Devices	N/A	Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket	N/A	N/A	Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula	Fisher Scientific	2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
Orbital shaker	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	18612139
Plastic transfer pipette	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum	Millipore Sigma	S3772-5ML
Stereomicroscope	Leica	10450103
Temperature-controlled incubator	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML