استخلاص اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي وتحديد درجة حرارة تخزينه
Summary
يصف البروتوكول الحالي استخراج اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي (AM) وظروف تخزينه كمستخلص AM (AME) عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما لتحديد بروتيناته وتركيز اللوميكان.
Abstract
Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين في الغشاء الأمنيوسي البشري (AM) الذي يعزز ظهارة القرنية وتنظيم ألياف الكولاجين ، والحفاظ على شفافية القرنية. في العمل الحالي ، تم اقتراح طريقة لاستخراج البروتين من AM للحصول على lumican. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم استقرار lumican في مستخلص AM (AME) المخزن في درجات حرارة وفترات زمنية مختلفة. تم إذابة 100 ملغ من AM وإزالة الظهارة الميكانيكية. تم تجميد AM المنزوع الظهارة وسحقه حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ، والذي تم إذابته ب 2.5 مل من المحلول الملحي مع مثبطات الأنزيم البروتيني والطرد المركزي لاستخراج البروتين. تم جمع المادة الطافية وتخزينها في -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما. بعد ذلك ، تم تحديد كمية lumican في كل AME. تسمح هذه التقنية ببروتوكول يمكن الوصول إليه واكتسابه لاستخراج اللوميكان من AM. تأثر تركيز اللوميكان بوقت التخزين وظروف درجة الحرارة. كان Lumican في AME لمدة 12 يوما مخزنا عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية أعلى بكثير من AME الأخرى. يمكن أن يكون استخراج اللوميكان هذا مفيدا لتطوير العلاجات والحلول الصيدلانية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد استخدامات AME lumican في عملية إعادة الاندمال وشفاء الجروح.
Introduction
واحدة من العلاجات الأكثر استخداما لأمراض القرنية هو زرع الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقترحات جديدة لاستخدام مكونات مختلفة من الأنسجة الأمنيوسية كعلاجات بديلة ومساعدة. من بين المكونات الأكثر دراسة من AM هي تلك التي تم الحصول عليها من استخراج AM (AME)1،2،3،4،5،6،7. يحتوي AM على العديد من العوامل القابلة للذوبان مثل البروتينات المضادة لتولد الأوعية ، والإنترلوكينات (IL) ، ومثبطات الأنسجة للبروتينات المعدنية (TIMPs) ، والبروتينات المضادة للالتهابات بوساطة TSG-6 التي تمنع مصائد العدلات خارج الخلية ، وعوامل النمو: عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل النمو المحول (TGF) (ألفا وبيتا) ، عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، عامل نمو خلايا الكبد (HGF) ، ولوميكان ، الذي يحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم تكوين ألياف الكولاجين1 ، 2،3،4،5،6،7،8،9.
Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين (SLRP) ، وهو أحد المكونات الرئيسية خارج الخلية للكولاجيناز الخلالي في مصفوفة سدى القرنية ، وهو مسؤول عن تنظيم ألياف الكولاجين والحفاظ على شفافية القرنية4،10،11. البروتيوغليكان هي جزيئات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي الجزيئات الرئيسية في تنفيذ إشارات الخلية والحفاظ على التوازن داخل الخلايا12. تم الإبلاغ عن بروتينات ECM لدفع العمليات الخلوية للانتشار والتمايز والهجرة أثناء التئام الجروح11.
تشير الأدلة إلى احتمال مشاركة اللوميكان في عملية إعادة الظهارة القرنية. أظهر Saika et al. ، في دراسة ، أنه بعد إصابة القرنية ، يمكن اكتشاف lumican في خلايا القرنية القرنية بين أول 8 ساعات وحتى 3 أيام بعد الإصابة. تقديم أعلى تركيز من lumican في اليوم الثاني والثالث ، وهذا البروتيوغليكان لا يمكن اكتشافه في اليوم السابع13. تشير هذه البيانات إلى مشاركة اللوميكان في تنشيط عملية إعادة الاندمال الظهاري للقرنية. من ناحية أخرى ، في دراسة أخرى ، أفيد أن عدم وجود lumican يؤخر إعادة الاندمال الظهاري. ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة Lumican يمكن أن يسرع عملية إعادة الاندمال الظهاري4،11،13. وبالمثل ، أفادت دراسة حديثة أن اللوميكان يمكن أن يعدل الوظائف الالتهابية للخلايا الليفية القرنية14 ، مما يشير إلى دور اللوميكان كمغير للاستجابة الالتهابية والمضادة للتليف وإعادة الاندمال. وبالمثل ، يمكن لوميكان تعديل استجابة القرنية من خلال التفاعل مع جزيئات الإشارة مثل Fas-FasL. أيضا ، أظهر غياب lumican في نموذج Lum–/- mouse بالضربة القاضية أن عدم وجود إشارات lumican يمنع إصلاح القرنية الكافي15.
في المقام الأول ، تهدف هذه الطريقة إلى إظهار طريقة مجدية وسهلة لاستخراج اللوميكان من AM. باستخدام هذه الطريقة المفيدة لاستخراج اللوميكان ، من الممكن الحصول على تركيزات مماثلة من البروتينات ، مما يقلل من وقت المعالجة ويجعلها أكثر ملاءمة للمحققين مقارنة بالدراسات السابقة16. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام AME lumican كمساعد لإصلاح القرنية وعمليات إعادة الاندمال الظهاري.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم تحليل وجود lumican في AME وعلاقته المباشرة مع ثباته في ظل ظروف التخزين المختلفة. ومن المثير للاهتمام ، عندما تم تحديد تركيز البروتين الكلي في AME ، زاد تركيز البروتين بعد التخزين. تشير الدلائل إلى ثلاث آليات يمكن أن تغير تركيز البروتين في التخزين المجمد: التمسخ البارد ، والترك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
