Extracción de Lumican de la membrana amniótica y determinación de su temperatura de almacenamiento
Summary
El presente protocolo describe la extracción de lumican de la membrana amniótica (AM) y sus condiciones de almacenamiento como extracto de AM (AME) a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días para cuantificar sus proteínas y la concentración de lumicano.
Abstract
Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina en la membrana amniótica humana (AM) que promueve la epitelización corneal y la organización de las fibras de colágeno, manteniendo la transparencia corneal. En el presente trabajo, se propone un método de extracción de proteínas de AM para obtener lumican. Además, se evalúa la estabilidad de lumicano en el extracto AM (AME) almacenado a diferentes temperaturas y períodos de tiempo. 100 mg de AM fueron descongelados y desepitelizados mecánicamente. La AM desepitelizada se congeló y trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de la proteasa y se centrifugó para la extracción de proteínas. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días. Posteriormente, lumican se cuantificó en cada AME. Esta técnica permite un protocolo accesible y adquirible para la extracción lumican de AM. La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. Lumican en el AME de 12 días almacenado a -20 °C y 4 °C fue significativamente mayor que otros AME. Esta extracción lumica podría ser útil para desarrollar tratamientos y soluciones farmacéuticas. Se necesitan estudios adicionales para determinar los usos de AME lumican en el proceso de reepitelización y cicatrización de heridas.
Introduction
Uno de los tratamientos más utilizados para las afecciones corneales es el trasplante de membrana amniótica; Sin embargo, en los últimos años, han surgido nuevas propuestas para utilizar diversos componentes del tejido amniótico como tratamientos alternativos y adyuvantes. Entre los componentes más estudiados de AM se encuentran los obtenidos del extracto de AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene múltiples factores solubles como proteínas antiangiogénicas, interleucinas (IL), inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP), proteínas antiinflamatorias mediadas por TSG-6 que inhiben las trampas extracelulares de neutrófilos, factores de crecimiento: factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF) (alfa y beta), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y lumican, que mantiene la transparencia corneal mediante la regulación de la fibrilogénesisde colágeno 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina (SLRP), uno de los principales componentes extracelulares de la colagenasa intersticial en la matriz del estroma corneal, responsable de organizar las fibras de colágeno y mantener la transparencia corneal 4,10,11. Los proteoglicanos son moléculas de la matriz extracelular (MEC), que son las principales en la realización de la señalización celular y el mantenimiento de la homeostasis intracelular12. Se ha informado que las proteínas ECM impulsan los procesos celulares de proliferación, diferenciación y migración durante la cicatrización de heridas11.
La evidencia indica la posible participación de lumican en el proceso de reepitelización corneal. Saika et al., en un estudio, demostraron que después de una lesión corneal, lumican podría detectarse en queratocitos corneales entre las primeras 8 h y hasta 3 días después de la lesión. Presentando la mayor concentración de lumicano en el segundo y tercer día, este proteoglicano es posteriormente indetectable en el séptimo día13. Estos datos sugieren la participación de lumican en la activación del proceso de reepitelización corneal. Por otro lado, en otro estudio, se informó que la ausencia de lumicano retrasa la reepitelización; Curiosamente, la adición de Lumican podría acelerar el proceso de reepitelización 4,11,13. Asimismo, un estudio reciente ha reportado que lumican puede modular las funciones inflamatorias de los fibroblastos del limbo corneal14, lo que sugiere un papel para lumican como modulador de la respuesta inflamatoria, antifibrótica y reepitelizante. Del mismo modo, lumican puede modular la respuesta corneal interactuando con moléculas de señalización como Fas-FasL. Además, la ausencia de lumican en un modelo de ratón Lum–/- knockout demostró que la falta de señalización lumican impide una reparación corneal adecuada15.
Principalmente, este método tiene como objetivo demostrar una forma factible y accesible de extraer lumican de AM. Con este ventajoso método de extracción lumicana, es posible obtener concentraciones similares de proteínas, disminuyendo el tiempo de procesamiento y haciéndolo más conveniente para los investigadores en comparación con los estudios previos16. Además, este AME lumican podría usarse como adyuvante para procesos de reparación y reepitelización corneal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se analizó la presencia de lumican en el AME y su correlación directa con su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Curiosamente, cuando se cuantificó la concentración total de proteína en AME, la concentración de proteína aumentó después del almacenamiento. La evidencia sugiere tres mecanismos que podrían cambiar la concentración de proteínas en el almacenamiento congelado: la desnaturalización en frío, la concentración congelada de solutos y el despliegue parcial indu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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