Mevcut protokol, lumikanın amniyotik membrandan () ekstraksiyonunu ve depolama koşullarını, proteinlerini ve lumikan konsantrasyonunu ölçmek için -20 ° C, 4 ° C'de ekstraktı (AME) ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) olarak tanımlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Amniyotik membrandan Lumikan ekstraksiyonu ve depolama sıcaklığının belirlenmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Lumikan, insan amniyotik membranında () kornea epitelizasyonunu ve kollajen liflerinin organizasyonunu teşvik eden, kornea saydamlığını koruyan küçük bir lösin bakımından zengin proteoglikandır. Bu çalışmada, lumikan elde etmek için'den protein ekstraksiyonu için bir yöntem önerilmiştir. Ek olarak, farklı sıcaklık ve zaman periyotlarında depolanan ekstraktındaki (AME) lumikanın stabilitesi değerlendirilir. 100 mg çözüldü ve mekanik olarak epitelden arındırıldı. Deepitelize edilmiş, proteaz inhibitörleri ile 2.5 mL salin tamponu ile çözündürülen ve protein ekstraksiyonu için santrifüj edilen ince bir toz elde edilene kadar donduruldu ve ezildi. Süpernatant toplandı ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca -20 ° C, 4 ° C ve oda sıcaklığında (RT) saklandı. Daha sonra, lumican her AME'de nicelleştirildi. Bu teknik,'den lumikan ekstraksiyonu için erişilebilir ve edinilebilir bir protokol sağlar. Lumikan konsantrasyonu depolama süresi ve sıcaklık koşullarından etkilendi. -20 ° C ve 4 ° C'de depolanan 12 günlük AME'deki Lumikan, diğer AME'lerden önemli ölçüde daha yüksekti. Bu lumican ekstraksiyonu, tedaviler ve farmasötik çözeltiler geliştirmek için yararlı olabilir. AME lumikan'ın reepitelizasyon ve yara iyileşme sürecindeki kullanımlarını belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Giriş
Kornea etkileri için en çok kullanılan tedavilerden biri amniyotik membran transplantasyonudur; ancak son yıllarda amniyotik dokunun çeşitli bileşenlerinin alternatif ve adjuvan tedaviler olarak kullanılması için yeni öneriler ortaya çıkmıştır. 'nin en çok çalışılan bileşenleri arasında ekstraktından (AME) elde edilenler 1,2,3,4,5,6,7'dir. , antianjiyojenik proteinler, interlökinler (IL), metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'le....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneysel prosedürler Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Proje No. CEI-2020/06/04). , Chavez-García ve ark.17 tarafından tanımlandığı gibi hazırlanan Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amniyon bankasından (tanımlanmamış insan deneklerden) elde edilmiştir.
1. Amniyotik membran ekstraktının hazırlanması
- Amniyon bankasından 100 mg alın.
NOT: Önceki bir rapora göre, 50 mg toplam 10 ng / mL lumican14 salgılar. Daha yüksek bir lumikan konsantrasyonu elde etmek için, toplam 32cm2'lik bir alana eşdeğer 100 mg kullanın.
....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sonuçlar standart sapmanın (SD) ortalama değeri ± olarak raporlanır. Öğrencinin t-testleri ve varyans analizi (ANOVA) yapıldı. 0.05 < P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel analiz, istatistik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
AME'deki toplam protein miktarı zaman ve depolama koşullarından etkilenmiştir. Bazal protein konsantrasyonu tüm AME arasında benzerdi; toplam protein aralığı, değerlend.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, AME'de lumikanın varlığı ve farklı depolama koşulları altındaki stabilitesi ile doğrudan ilişkisi analiz edilmiştir. İlginç bir şekilde, AME'deki toplam protein konsantrasyonu ölçüldüğünde, protein konsantrasyonu depolamadan sonra artmıştır. Kanıtlar, dondurulmuş depodaki protein konsantrasyonunu değiştirebilecek üç mekanizma önermektedir: soğuk denatürasyon, çözünenlerin dondurulmuş konsantrasyonu ve protein yapısının buzla indüklenen kısmi açılması19. Dondurma işlemi, numunedeki sı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çalışma, Universidad Nacional Autonoma de Mexico Araştırma ve Teknolojik İnovasyon Projeleri Destek Programı (Hibe No. PAPIIT IN203821) ve Eğitim, Bilim, Teknoloji ve İnovasyon Bakanlığı (Hibe No. SECTEI 250/2019) tarafından finanse edilmiştir.
Teşekkürler
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 N H < alt > 2 < / alt > SO< alt > 4< / alt> durdurma çözümü | R& D Sistemleri | DY994 | |
| 100 μ L mikropipet | Eppendorf | ||
| 1000 μ L mikropipet | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri kabı | Symlaboratorios | ||
| 18 G İğne (1,2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | ||
| 2 mL mikrosantrifüj tüpü | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastik şırınga | BD Becton Dickinson | ||
| 302562 20 & mu; L mikropipet | Eppendorf | ||
| 20-200 μ L mikropipet | Eppendorf | ||
| 5 mL mikrosantrifüj tüpü | Eppendorf | 30119401 | |
| 96 oyuklu mikroplaka | SARSTEDT | 821581 | |
| Alüminyum folyo | N/A | N/A | |
| Amniyotik membran | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Dengeli tuz çözeltisi | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beher | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figür tasarımı | |
| Kompakt Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| eksiksiz, EDTA içermeyen, Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri | Roche | 11 873 580 001 | Proteaz İnhibitörü |
| Daiggner girdap Genie 2 | A.Daigger & Co., INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plaka spektrometresi | Thermo Labsystems & nbsp; | 35401106 | |
| Multiscan Dondurucu | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | versiyon 9 | istatistiksel analiz ve grafik programı |
| İnsan lumican DuoSet ELISA kiti | R& D Systems | DY2846-05 | , insan Lumican yakalama antikoru |
| İnkübatörünü içerir ve nbsp; | Forma Bilimsel | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Ters Işık Mikroskobu | Olympus | 6A13921 | de-epitelizasyonu doğrulamak için Mod.CK2 |
| Laminer akış başlığı | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Sıvı nitrojen | N/A | N/A | |
| Harç | N/A | N/A | |
| Çok kanallı pipetleyici | Eppendorf | ||
| Azot Tankı | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Kağıt havlu | N/A | N/A | |
| Fosfat tamponlu tuzlu su ürünleri | R& D Systems | DY006 | |
| Pierce Modifiye Lowry Protein Test Kiti | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plaka kapatıcılar | R& D Systems | DY992 | |
| Reaktif seyreltici | Ar-Ge D Sistemleri | DY995 | PBS'de% 1 BSA, pH 7.2-7.4, 0.2 & mu; m filtreli |
| Soğutmalı santrifüj | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Kauçuk polis hücre sıyırıcı | NEST | 710001 | mekanik de-epitelizasyon için |
| Neşter bıçağı | Braun | BB521 | No. 10 veya 21 |
| Streptavidin-HRP 40 kat konsantre ve nbsp; | Ar-Ge D Systems | bölüm 893975 | |
| Substrat tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisi | R& D Systems | DY999 | |
| Dişli cımbız | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultra saf su | PISA | ||
| Yıkama tamponu | R& D Sistemleri | WA126 | PBS'de %0,05 Tween 20, pH 7,2-7,4 |
Kaynaklar
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
