מיצוי לומיקן מממברנת מי השפיר וקביעת טמפרטורת האחסון שלו
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את מיצוי הלומיקאן מממברנת מי השפיר (AM) ואת תנאי האחסון שלהם כתמצית AM (AME) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר (RT) במשך 6, 12, 20 ו-32 ימים כדי לכמת את החלבונים ואת ריכוז הלומיקאן.
Abstract
Lumican הוא פרוטאוגליקן קטן עשיר בלאוצין בקרום מי השפיר האנושי (AM) המקדם אפיתל הקרנית וארגון סיבי קולגן, תוך שמירה על שקיפות הקרנית. בעבודה הנוכחית, שיטה למיצוי חלבון מ AM כדי להשיג lumican הוא הציע. בנוסף, מעריכה את יציבות הלומיקאן בתמצית AM (AME) המאוחסנת בטמפרטורות ובתקופות זמן שונות. 100 מ”ג של AM הופשרו ועברו דה-אפיתל מכני. ה- AM שעבר דה-אפיתל הוקפא ונמחץ עד שהתקבלה אבקה דקה, אשר סולובילציה עם 2.5 מ”ל של חיץ מלוחים עם מעכבי פרוטאז וצנטריפוגה למיצוי חלבונים. הסופר-נאטנט נאסף ואוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס ובטמפרטורת החדר (RT) למשך 6, 12, 20 ו-32 ימים. לאחר מכן, לומיקן כומת בכל AME. טכניקה זו מאפשרת פרוטוקול נגיש וניתן לרכישה למיצוי לומיקן מ- AM. ריכוז לומיקן הושפע מזמן האחסון ומתנאי הטמפרטורה. Lumican ב AME של 12 ימים מאוחסנים ב -20 °C ו 4 °C היה גבוה משמעותית מאשר AME אחרים. מיצוי לומיקן זה יכול להיות שימושי לפיתוח טיפולים ופתרונות תרופתיים. מחקרים נוספים נדרשים כדי לקבוע את השימושים של AME lumican באפיתל מחדש ותהליך ריפוי פצעים.
Introduction
אחד הטיפולים הנפוצים ביותר עבור רגשות הקרנית הוא השתלת קרום מי השפיר; עם זאת, בשנים האחרונות עלו הצעות חדשות לשימוש במרכיבים שונים של רקמת מי השפיר כטיפולים אלטרנטיביים ואדג’ובנטיים. בין המרכיבים הנחקרים ביותר של AM הם אלה המתקבלים תמצית AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM מכיל גורמים מסיסים מרובים כגון חלבונים אנטי-אנגיוגניים, אינטרלוקינים (IL), מעכבי רקמות של מטאלופרוטאינאזות (TIMPs), חלבונים אנטי דלקתיים בתיווך TSG-6 המעכבים מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות, גורמי גדילה: גורם גדילה אפידרמלי (EGF), גורם גדילה מתמיר (TGF) (אלפא ובטא), גורם גדילה קרטינוציטים (KGF), גורם גדילה הפטוציטים (HGF) ולומיקן, השומר על שקיפות הקרנית על ידי ויסות פיברילוגנזה של קולגן1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican הוא פרוטאוגליקן קטן עשיר בלאוצין (SLRP), אחד המרכיבים החוץ-תאיים העיקריים של קולגן בין-תאי במטריצת הסטרומה של הקרנית, האחראי על ארגון סיבי הקולגן ושמירה על שקיפות הקרנית 4,10,11. פרוטאוגליקנים הם מולקולות במטריצה החוץ-תאית (ECM), שהן העיקריות שבהן בביצוע איתות תאי ובשמירה על הומאוסטזיס תוך-תאי12. דווח כי חלבוני ECM מניעים את התהליכים התאיים של התפשטות, התמיינות ונדידה במהלך ריפוי פצעים11.
ראיות מצביעות על השתתפות אפשרית של lumican בתהליך של אפיתל מחדש הקרנית. Saika et al., במחקר, הראו כי לאחר פגיעה בקרנית, ניתן לזהות לומיקן בקרטוציטים של הקרנית בין 8 השעות הראשונות ועד 3 ימים לאחר הפציעה. הצגת הריכוז הגבוה ביותר של lumican ביום השני והשלישי, פרוטאוגליקן זה הוא לאחר מכן בלתי ניתן לגילוי ביום השביעי13. נתונים אלה מצביעים על השתתפות של lumican בהפעלת תהליך אפיתל מחדש של הקרנית. מאידך גיסא, במחקר אחר, דווח כי היעדר לומיקן מעכב אפיתל מחדש; באופן מעניין, הוספת לומיקן יכולה להאיץ את תהליך האפיתל מחדש 4,11,13. כמו כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי lumican יכול לווסת את הפונקציות הדלקתיות של פיברובלסטים לימבוס הקרנית14, אשר מציע תפקיד עבור lumican כמו מודולטור של התגובה דלקתית, antifibrotic ו אפיתל מחדש. באופן דומה, לומיקן יכול לווסת את תגובת הקרנית על ידי אינטראקציה עם מולקולות איתות כגון Fas-FasL. כמו כן, היעדר לומיקן במודל עכבר נוקאאוט Lum–/- הוכיח כי היעדר איתות לומיקן מונע תיקון קרנית הולם15.
בראש ובראשונה, שיטה זו נועדה להדגים דרך אפשרית ונגישה לחלץ לומיקן מ- AM. בשיטה מועילה זו של מיצוי לומיקן, ניתן להשיג ריכוזים דומים של חלבונים, מה שמקטין את זמן העיבוד והופך אותו לנוח יותר לחוקרים בהשוואה למחקרים הקודמים16. יתר על כן, לומיקן AME זה יכול לשמש כאדג’ובנט לתיקון הקרנית ולתהליכי אפיתל מחדש.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, נוכחות של lumican נותח ב AME ואת המתאם הישיר שלה עם יציבותו בתנאי אחסון שונים. באופן מעניין, כאשר כימתו את ריכוז החלבון הכולל ב-AME, ריכוז החלבון עלה לאחר האחסון. הראיות מצביעות על שלושה מנגנונים שיכולים לשנות את ריכוז החלבון באחסון קפוא: דנטורציה קרה, ריכוז המומסים הקפואים והתגלגלות חלק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
