Настоящий протокол описывает извлечение люмиканов из амниотической мембраны (AM) и условия их хранения в виде экстракта AM (AME) при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней для количественной оценки его белков и концентрации люмиканов.
Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан в амниотической мембране человека (АМ), который способствует эпителизации роговицы и организации коллагеновых волокон, поддерживая прозрачность роговицы. В настоящей работе предложен способ экстракции белка из АМ для получения люмикана. Кроме того, оценивается стабильность люмикана в экстракте AM (AME), хранящемся при различных температурах и периодах времени. 100 мг АМ размораживали и механически деэпителизировали. Деэпителиализованный АМ замораживали и измельчали до получения мелкого порошка, который солюбилизировали 2,5 мл физиологического буфера с ингибиторами протеазы и центрифугировали для экстракции белка. Супернатант собирали и хранили при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней. После этого люмикан был количественно определен в каждом AME. Этот метод позволяет создать доступный и доступный протокол для извлечения люмиканов из AM. На концентрацию люмикана влияли время хранения и температурные условия. Люмикан в АМЕ 12 дней хранился при -20 °C и 4 °C был значительно выше, чем в других AME. Эта экстракт люмикана может быть полезна для разработки методов лечения и фармацевтических решений. Необходимы дальнейшие исследования для определения использования люмикана AME в процессе реэпителизации и заживления ран.
Одним из наиболее часто используемых методов лечения поражений роговицы является трансплантация амниотической мембраны; однако в последние годы появились новые предложения по использованию различных компонентов амниотической ткани в качестве альтернативных и адъювантных методов лечения. К числу наиболее изученных компонентов АМ относятся те, которые получены из экстракта АМ (АМЕ)1,2,3,4,5,6,7. AM содержит множество растворимых факторов, таких как антиангиогенные белки, интерлейкины (IL), тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs), противовоспалительные белки, опосредованные TSG-6, которые ингибируют внеклеточные ловушки нейтрофилов, факторы роста: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF) (альфа и бета), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и люмикан, который поддерживает прозрачность роговицы путем регулирования фибрилтогенеза коллагена1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан (SLRP), один из основных внеклеточных компонентов интерстициальной коллагеназы в матрице стромы роговицы, отвечающий за организацию коллагеновых волокон и поддержание прозрачности роговицы 4,10,11. Протеогликаны представляют собой молекулы во внеклеточном матриксе (ECM), которые являются основными в проведении клеточной сигнализации и поддержании внутриклеточного гомеостаза12. Сообщалось, что белки ECM управляют клеточными процессами пролиферации, дифференцировки и миграции во время заживления ран11.
Данные свидетельствуют о возможном участии люмикана в процессе реэпителизации роговицы. Saika et al. в исследовании показали, что после травмы роговицы люмикан может быть обнаружен в кератоцитах роговицы между первыми 8 ч и до 3 дней после травмы. Представляя самую высокую концентрацию люмикана на второй и третий день, этот протеогликан впоследствии не обнаруживается на седьмой день13. Эти данные свидетельствуют об участии люмикана в активации процесса реэпителизации роговицы. С другой стороны, в другом исследовании сообщалось, что отсутствие люмиканов задерживает реэпителизацию; Интересно, что добавление люмикана может ускорить процесс реэпителизации 4,11,13. Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что люмикан может модулировать воспалительные функции фибробластов роговицылимбуса 14, что предполагает роль люмикана в качестве модулятора воспалительного, антифиброзивного и реэпителиализирующего ответа. Аналогичным образом, люмикан может модулировать реакцию роговицы, взаимодействуя с сигнальными молекулами, такими как Fas-FasL. Кроме того, отсутствие люмикана в нокаутной модели Lum-/- мыши продемонстрировало, что отсутствие люмиканной сигнализации препятствует адекватному восстановлению роговицы15.
В первую очередь, этот метод направлен на демонстрацию осуществимого и доступного способа извлечения люмикана из AM. С помощью этого предпочтительного метода экстракции люмиканов можно получить аналогичные концентрации белков, уменьшая время обработки и делая его более удобным для исследователей по сравнению с предыдущими исследованиями16. Кроме того, этот люмикан AME может быть использован в качестве адъюванта для процессов восстановления и реэпителизации роговицы.
В данном исследовании анализировалось наличие люмикана в АМЕ и его прямая корреляция с его стабильностью при различных условиях хранения. Интересно, что когда общая концентрация белка в АМЕ была количественно определена, концентрация белка увеличивалась после хранения. Данные свидет…
The authors have nothing to disclose.
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
100 μL micropipette | Eppendorf | ||
1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
20 μL micropipette | Eppendorf | ||
20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
Aluminum foil | N/A | N/A | |
Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
Beaker | N/A | N/A | |
BioRender | BioRender | figures design | |
Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
Freezer | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mortar | N/A | N/A | |
Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
Paper towels | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
Ultrapure water | PISA | ||
Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |