Extraction de lumican à partir d’une membrane amniotique et détermination de sa température de stockage
Summary
Le présent protocole décrit l’extraction du lumican de la membrane amniotique (AM) et leurs conditions de stockage sous forme d’extrait de MA (AME) à -20 °C, 4 °C et à température ambiante (RT) pendant 6, 12, 20 et 32 jours pour quantifier ses protéines et sa concentration en lumicane.
Abstract
Lumican est un petit protéoglycane riche en leucine dans la membrane amniotique humaine (AM) qui favorise l’épithélialisation cornéenne et l’organisation des fibres de collagène, en maintenant la transparence cornéenne. Dans le présent travail, une méthode d’extraction de protéines de la FA pour obtenir du lumican est proposée. De plus, la stabilité du lumican dans l’extrait AM (AME) stocké à différentes températures et périodes est évaluée. 100 mg de MA ont été décongelés et déépithélialisés mécaniquement. La MA désépithélialisée a été congelée et broyée jusqu’à l’obtention d’une poudre fine, qui a été solubilisée avec 2,5 mL de tampon saline avec des inhibiteurs de protéase et centrifugée pour l’extraction des protéines. Le surnageant a été recueilli et conservé à -20 °C, 4 °C et à température ambiante (RT) pendant 6, 12, 20 et 32 jours. Par la suite, le lumican a été quantifié dans chaque TEA. Cette technique permet un protocole accessible et acquis pour l’extraction du lumican à partir de la FA. La concentration de lumican a été affectée par le temps de stockage et les conditions de température. Le Lumican dans le TEA de 12 jours stocké à -20 °C et 4 °C était significativement plus élevé que les autres TEA. Cette extraction de lumican pourrait être utile pour développer des traitements et des solutions pharmaceutiques. D’autres études sont nécessaires pour déterminer les utilisations du lumican AME dans la réépithélialisation et le processus de cicatrisation.
Introduction
L’un des traitements les plus utilisés pour les affections cornéennes est la greffe de membrane amniotique; Cependant, au cours des dernières années, de nouvelles propositions ont émergé pour l’utilisation de divers composants du tissu amniotique comme traitements alternatifs et adjuvants. Parmi les composants les plus étudiés de la FA figurent ceux obtenus à partir de l’extrait d’AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. La MA contient de multiples facteurs solubles tels que des protéines antiangiogéniques, des interleukines (IL), des inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases (TIMPs), des protéines anti-inflammatoires médiées par TSG-6 qui inhibent les pièges extracellulaires des neutrophiles, des facteurs de croissance: facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance transformant (TGF) (alpha et bêta), facteur de croissance kératinocytaire (KGF), facteur de croissance hépatocytes (HGF) et lumican, qui maintient la transparence cornéenne en régulant la fibrillogenèse du collagène1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Le lumican est un petit protéoglycane riche en leucine (SLRP), l’un des principaux composants extracellulaires de la collagénase interstitielle dans la matrice du stroma cornéen, responsable de l’organisation des fibres de collagène et du maintien de la transparence cornéenne 4,10,11. Les protéoglycanes sont des molécules de la matrice extracellulaire (MEC), qui sont les principales dans la réalisation de la signalisation cellulaire et le maintien de l’homéostasie intracellulaire12. Il a été rapporté que les protéines ECM conduisent les processus cellulaires de prolifération, de différenciation et de migration pendant la cicatrisation des plaies11.
Les preuves indiquent la participation possible du lumican dans le processus de réépithélialisation cornéenne. Saika et al., dans une étude, ont montré qu’après une lésion cornéenne, le lumican pouvait être détecté dans les kératocytes cornéens entre les 8 premières heures et jusqu’à 3 jours après la blessure. Présentant la plus forte concentration de lumican le deuxième et le troisième jour, ce protéoglycane est par la suite indétectable le septième jour13. Ces données suggèrent la participation du lumican dans l’activation du processus de réépithélialisation cornéenne. D’autre part, dans une autre étude, il a été rapporté que l’absence de lumican retarde la réépithélialisation; Fait intéressant, l’ajout de Lumican pourrait accélérer le processus de réépithélialisation 4,11,13. De même, une étude récente a rapporté que le lumican peut moduler les fonctions inflammatoires des fibroblastes du limbe cornéen14, ce qui suggère un rôle pour le lumican en tant que modulateur de la réponse inflammatoire, antifibrotique et ré-épithélialisante. De même, le lumican peut moduler la réponse cornéenne en interagissant avec des molécules de signalisation telles que Fas-FasL. De plus, l’absence de lumican dans un modèle Lum-/- souris knockout a démontré que l’absence de signalisation lumican empêche une réparation cornéenne adéquate15.
Principalement, cette méthode vise à démontrer un moyen réalisable et accessible d’extraire le lumican de la FA. Avec cette méthode avantageuse d’extraction du lumican, il est possible d’obtenir des concentrations similaires de protéines, ce qui diminue le temps de traitement et le rend plus pratique pour les chercheurs par rapport aux études précédentes16. De plus, ce lumican AME pourrait être utilisé comme adjuvant pour les processus de réparation et de réépithélialisation de la cornée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, la présence de lumican a été analysée dans le TEA et sa corrélation directe avec sa stabilité dans différentes conditions de stockage. Fait intéressant, lorsque la concentration totale de protéines dans la TEA a été quantifiée, la concentration de protéines a augmenté après le stockage. Les preuves suggèrent trois mécanismes qui pourraient modifier la concentration de protéines dans l’entreposage congelé : la dénaturation à froid, la concentration congelée de solutés et le dép…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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