Lumican-Extraktion aus Amnionmembran und Bestimmung ihrer Lagertemperatur
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Extraktion von Lumican aus der Amnionmembran (AM) und deren Lagerbedingungen als AM-Extrakt (AME) bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage, um seine Proteine und Lumican-Konzentration zu quantifizieren.
Abstract
Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan in der menschlichen Amnionmembran (AM), das die Hornhautepithelisierung und die Organisation von Kollagenfasern fördert und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Proteinextraktion aus AM vorgeschlagen, um Lumican zu erhalten. Zusätzlich wird die Stabilität von Lumican im AM-Extrakt (AME) bewertet, der bei verschiedenen Temperaturen und Zeiträumen gelagert wird. 100 mg AM wurden aufgetaut und mechanisch deepithelialisiert. Das deepithelialisierte AM wurde eingefroren und zerkleinert, bis ein feines Pulver erhalten wurde, das mit 2,5 ml Kochsalzpuffer mit Proteaseinhibitoren gelöst und zur Proteinextraktion zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20 °C, 4 °C und Raumtemperatur (RT) für 6, 12, 20 und 32 Tage gelagert. Danach wurde Lumican in jedem AME quantifiziert. Diese Technik ermöglicht ein zugängliches und erwerbbares Protokoll für die Lumican-Extraktion aus AM. Die Lumican-Konzentration wurde durch die Lagerzeit und die Temperaturbedingungen beeinflusst. Lumican in der AME von 12 Tagen Lagerung bei -20 °C und 4 °C war signifikant höher als andere AME. Diese Lumican-Extraktion könnte für die Entwicklung von Behandlungen und pharmazeutischen Lösungen nützlich sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die Verwendung von AME Lumican bei der Reepithelialisierung und Wundheilung zu bestimmen.
Introduction
Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungen für Hornhauterkrankungen ist die Amnionmembrantransplantation; In den letzten Jahren sind jedoch neue Vorschläge für die Verwendung verschiedener Bestandteile des Fruchtwassergewebes als alternative und adjuvante Behandlungen aufgetaucht. Zu den am meisten untersuchten Komponenten von AM gehören diejenigen, die aus dem AM-Extrakt (AME) 1,2,3,4,5,6,7 gewonnen werden. AM enthält mehrere lösliche Faktoren wie antiangiogene Proteine, Interleukine (IL), Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs), entzündungshemmende Proteine, die durch TSG-6 vermittelt werden und neutrophile extrazelluläre Fallen hemmen, Wachstumsfaktoren: epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF) (alpha und beta), Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Lumican, das die Transparenz der Hornhaut durch Regulierung der Kollagenfibrillogenese aufrechterhält1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican ist ein kleines leucinreiches Proteoglykan (SLRP), eine der wichtigsten extrazellulären Komponenten der interstitiellen Kollagenase in der Hornhautstromamatrix, verantwortlich für die Organisation von Kollagenfasern und die Aufrechterhaltung der Hornhauttransparenz 4,10,11. Proteoglykane sind Moleküle in der extrazellulären Matrix (ECM), die die wichtigsten bei der Durchführung von Zellsignalen und der Aufrechterhaltung der intrazellulären Homöostasesind 12. Es wurde berichtet, dass ECM-Proteine die zellulären Prozesse der Proliferation, Differenzierung und Migration während der Wundheilung antreiben11.
Hinweise auf die mögliche Beteiligung von Lumican am Prozess der Hornhautreepithelisierung. Saika et al. zeigten in einer Studie, dass nach einer Hornhautverletzung Lumican in Hornhautkeratozyten zwischen den ersten 8 h und bis zu 3 Tagen nach der Verletzung nachgewiesen werden konnte. Dieses Proteoglykan weist am zweiten und dritten Tag die höchste Konzentration von Lumican auf und ist anschließend am siebten Tag13 nicht nachweisbar. Diese Daten deuten auf die Beteiligung von Lumican an der Aktivierung des Hornhaut-Reepithelisierungsprozesses hin. Auf der anderen Seite wurde in einer anderen Studie berichtet, dass das Fehlen von Lumican die Reepithelialisierung verzögert; Interessanterweise könnte die Zugabe von Lumican den Reepithelisierungsprozessbeschleunigen 4,11,13. Ebenso hat eine kürzlich durchgeführte Studie berichtet, dass Lumican die entzündlichen Funktionen von Hornhautlimbus-Fibroblastenmodulieren kann 14, was auf eine Rolle von Lumican als Modulator der entzündlichen, antifibrotischen und reepithelialisierenden Reaktion hindeutet. In ähnlicher Weise kann Lumican die Hornhautreaktion modulieren, indem es mit Signalmolekülen wie Fas-FasL interagiert. Auch das Fehlen von Lumican in einem Knockout-Lum-/- Mausmodell zeigte, dass das Fehlen von Lumican-Signalen eine adäquate Hornhautreparatur verhindert15.
In erster Linie zielt diese Methode darauf ab, einen praktikablen und zugänglichen Weg zur Extraktion von Lumican aus AM zu demonstrieren. Mit dieser vorteilhaften Methode der Lumican-Extraktion ist es möglich, ähnliche Konzentrationen von Proteinen zu erhalten, wodurch die Verarbeitungszeit verkürzt und für die Forscher im Vergleich zu den vorherigen Studien bequemer wird16. Darüber hinaus könnte dieses AME-Lumican als Adjuvans für Hornhautreparatur- und Reepithelisierungsprozesse verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde das Vorhandensein von Lumican im AME und seine direkte Korrelation mit seiner Stabilität unter verschiedenen Lagerbedingungen analysiert. Interessanterweise stieg die Proteinkonzentration nach der Lagerung an, wenn die Gesamtproteinkonzentration in AME quantifiziert wurde. Es gibt Hinweise auf drei Mechanismen, die die Proteinkonzentration in gefrorenen Lagern verändern könnten: kalte Denaturierung, die gefrorene Konzentration gelöster Stoffe und eisinduzierte teilweise Entfaltung der Proteinst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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