Lumican ekstraksjon fra fosterhinne og bestemmelse av lagringstemperatur
Summary
Den nåværende protokollen beskriver ekstraksjonen av lumikan fra fosterhinnen (AM) og deres lagringsforhold som AM-ekstrakt (AME) ved -20 ° C, 4 ° C og romtemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dager for å kvantifisere proteiner og lumikankonsentrasjon.
Abstract
Lumican er en liten leucinrik proteoglykan i den humane fosterhinnen (AM) som fremmer hornhindeepitelisering og organisering av kollagenfibre, og opprettholder hornhindegjennomsiktighet. I dette arbeidet foreslås en metode for proteinekstraksjon fra AM for å oppnå lumikan. I tillegg vurderes stabiliteten til lumikan i AM-ekstraktet (AME) lagret ved forskjellige temperaturer og tidsperioder. 100 mg additiv tilvirkning ble tint og mekanisk de-epithelialisert. Den de-epithelialiserte AM ble frosset og knust til et fint pulver ble oppnådd, som ble oppløst med 2,5 ml saltvannsbuffer med proteasehemmere og sentrifugert for proteinekstraksjon. Supernatanten ble samlet opp og oppbevart ved -20 °C, 4 °C og romtemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dager. Etterpå ble lumikan kvantifisert i hver AME. Denne teknikken tillater en tilgjengelig og anskaffelig protokoll for lumikanutvinning fra AM. Lumicankonsentrasjonen ble påvirket av lagringstid og temperaturforhold. Lumikan i AME på 12 dager lagret ved -20 °C og 4 °C var signifikant høyere enn ved annen AME. Denne lumikanekstraksjonen kan være nyttig for å utvikle behandlinger og farmasøytiske løsninger. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme bruken av AME lumikan i reepitelisering og sårhelingsprosess.
Introduction
En av de mest brukte behandlingene for hornhinneaffeksjon er fosterhinnetransplantasjon; De siste årene har det imidlertid kommet nye forslag om bruk av ulike komponenter i fostervann som alternativ og adjuvant behandling. Blant de mest studerte komponentene i AM er de som er hentet fra AM-ekstraktet (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM inneholder flere løselige faktorer som antiangiogene proteiner, interleukiner (IL), vevshemmere av metalloproteinaser (TIMPs), antiinflammatoriske proteiner mediert av TSG-6 som hemmer nøytrofile ekstracellulære feller, vekstfaktorer: epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor (TGF) (alfa og beta), keratinocytvekstfaktor (KGF), hepatocytvekstfaktor (HGF) og lumikan, som opprettholder hornhindegjennomsiktighet ved å regulere kollagenfibrillogenese1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican er en liten leucinrik proteoglykan (SLRP), en av de viktigste ekstracellulære komponentene i interstitiell kollagenase i hornhinnen stroma-matrisen, ansvarlig for å organisere kollagenfibre og opprettholde hornhindegjennomsiktighet 4,10,11. Proteoglykaner er molekyler i den ekstracellulære matrisen (ECM), som er de viktigste i å utføre cellesignalering og opprettholde intracellulær homeostase12. ECM-proteiner har blitt rapportert å drive de cellulære prosessene for spredning, differensiering og migrasjon under sårheling11.
Bevis indikerer mulig deltakelse av lumikan i prosessen med hornhinde-reepitelialisering. Saika et al., i en studie, viste at etter en hornhinneskade kunne lumikan påvises i hornhinnen keratocytter mellom de første 8 timene og opptil 3 dager etter skade. Denne proteoglykanen presenterer den høyeste konsentrasjonen av lumikan på den andre og tredje dagen, og kan senere ikke oppdages på den syvende dagen13. Disse dataene antyder deltakelse av lumikan i aktiveringen av hornhinnen reepiteliseringsprosessen. På den annen side ble det i en annen studie rapportert at fraværet av lumikan forsinker reepitelialisering; Interessant nok kan tilsetning av lumikan akselerere reepiteliseringsprosessen 4,11,13. På samme måte har en nylig studie rapportert at lumikan kan modulere de inflammatoriske funksjonene til hornhinnen limbus fibroblaster14, noe som antyder en rolle for lumikan som en modulator av inflammatorisk, antifibrotisk og reepitelial respons. På samme måte kan lumikan modulere hornhinneresponsen ved å interagere med signalmolekyler som Fas-FasL. Også fraværet av lumikan i en knockout Lum–/- musemodell viste at mangelen på lumikansignalering forhindrer tilstrekkelig hornhindereparasjon15.
Først og fremst tar denne metoden sikte på å demonstrere en gjennomførbar og tilnærmelig måte å trekke ut lumikan fra AM. Med denne fordelaktige metoden for lumikanekstraksjon er det mulig å oppnå lignende konsentrasjoner av proteiner, redusere behandlingstiden og gjøre det mer praktisk for etterforskere sammenlignet med tidligere studier16. Videre kan denne AME lumican brukes som en adjuvans for hornhindereparasjon og re-epithelialiseringsprosesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble tilstedeværelsen av lumikan analysert i AME og dens direkte korrelasjon med stabiliteten under forskjellige lagringsforhold. Interessant, når den totale proteinkonsentrasjonen i AME ble kvantifisert, økte proteinkonsentrasjonen etter lagring. Bevis tyder på tre mekanismer som kan endre proteinkonsentrasjonen i frossen lagring: kald denaturering, den frosne konsentrasjonen av løsemidler og isindusert delvis utfoldelse av proteinstruktur19. Fryseprosessen kan påvirke protei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
