Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke
Summary
Dieses Protokoll erstellt ein Modell der Knorpeldefekte in voller Dicke (FTCD), indem Löcher in die fetale Trochlea-Rinne von Ratten gebohrt und das anschließende Schmerzverhalten und die histopathologischen Veränderungen gemessen werden.
Abstract
Knorpeldefekte des Kniegelenks, die durch ein Trauma verursacht werden, sind eine häufige Sportgelenkverletzung in der Klinik und führen zu Gelenkschmerzen, Bewegungseinschränkungen und schließlich zu Kniearthrose (kOA). Eine wirksame Behandlung von Knorpeldefekten oder gar KOA gibt es jedoch kaum. Tiermodelle sind wichtig für die Entwicklung von therapeutischen Medikamenten, aber die bestehenden Modelle für Knorpeldefekte sind unbefriedigend. In dieser Arbeit wurde ein Full-Thickness-Knorpeldefekte-Modell (FTCD) erstellt, indem Löcher in die femorale Trochlea-Rinne von Ratten gebohrt wurden, und das anschließende Schmerzverhalten und die histopathologischen Veränderungen wurden als Ausleseexperimente verwendet. Nach der Operation war die mechanische Entzugsschwelle gesenkt, Chondrozyten an der verletzten Stelle gingen verloren, die Matrix-Metalloproteinase-MMP13-Expression war erhöht und die Typ-II-Kollagenexpression nahm ab, was mit den pathologischen Veränderungen übereinstimmt, die bei menschlichen Knorpeldefekten beobachtet wurden. Diese Methodik ist einfach und unkompliziert durchzuführen und ermöglicht eine grobe Beobachtung unmittelbar nach der Verletzung. Darüber hinaus kann dieses Modell klinische Knorpeldefekte erfolgreich nachahmen und bietet so eine Plattform, um den pathologischen Prozess von Knorpeldefekten zu untersuchen und entsprechende Therapeutika zu entwickeln.
Introduction
Gelenkknorpel ist ein hochdifferenziertes und dichtes Gewebe, das aus Chondrozyten und extrazellulärer Matrix besteht1. Die Oberflächenschicht des Gelenkknorpels ist eine Form des hyalinen Knorpels, der eine glatte Oberfläche, geringe Reibung, gute Festigkeit und Elastizität sowie eine ausgezeichnete mechanische Belastungstoleranzaufweist 2. Die extrazelluläre Matrix besteht aus Kollagenproteoglykan und Wasser, und Typ-II-Kollagen ist der Hauptstrukturbestandteil des Kollagens, da es etwa 90 % des gesamten Kollagensausmacht 3. Da im Knorpelgewebe keine Blutgefäße oder Nerven vorhanden sind, fehlt ihm die Fähigkeit, sich nach einer Verletzung selbst zu reparieren4. Daher sind Knorpeldefekte, die durch Traumata verursacht werden, seit jeher eine hartnäckige Gelenkerkrankung in Kliniken; Darüber hinaus betrifft diese Gelenkerkrankung tendenziell junge Menschen, und die weltweite Inzidenz nimmt zu 5,6. Das Kniegelenk ist der häufigste Ort von Knorpeldefekten, und Defekte gehen hier mit Gelenkschmerzen, Gelenkfunktionsstörungen und Gelenkknorpeldegeneration einher, was schließlich zu einer Kniearthrose (kOA) führt7. Knorpeldefekte des Kniegelenks stellen wirtschaftliche und physiologische Belastungen für die Patienten dar und beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten erheblich8. Diese Krankheit stellt eine große und dringende klinische Herausforderung dar, für die es keine unmittelbaren Lösungen gibt. Derzeit ist die Operation die Hauptstütze der Behandlung von Knorpeldefekten, aber ihr langfristiges Ergebnis ist nach wie vor unbefriedigend9.
Klinische Knorpeldefekte führen schließlich zu kOA, und daher werden kOA-Tiermodelle häufig für die pathologische Untersuchung von Knorpeldefekten und die Entwicklung von Medikamenten verwendet. Für das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Knorpeldefektreparatur ist die Etablierung von Tiermodellen wichtig, mit denen die Knorpelregeneration und der Wechsel zwischen Faserknorpel und hyalinem Knorpel beobachtet werden können10. Häufig verwendete kOA-Tiermodelle, wie z. B. chirurgische Modelle der vorderen Kreuzbanddurchtrennung (ACLT), der Destabilisierung des Innenmeniskus (DMM), der Ovariektomie (OVX) und Hulth, benötigen jedoch in der Regel eine Langzeitmodellierung und ermöglichen nur pathologische und schmerzliche Beurteilungen, was die Effizienz der Arzneimittelentwicklung einschränkt11. Neben den chirurgischen Modellen führen auch chemische Modelle wie Monojodacetat (MIA) und Papain-Injektion zu Knorpeldefekten, aber der Grad des Defekts kann nicht gut behandelt werden, und die Bedingungen sind weit von der klinischen Realität entfernt11. Die Kollision ist ein weiterer Ansatz, um Knorpeldefekte bei größeren Tieren zu modellieren, aber diese Methode hängt vom Einsatz spezifischer Instrumente ab und wird selten angewendet12.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die bestehenden kOA-Modelle nicht ideal sind, um die Pathogenese von Knorpeldefekten zu untersuchen oder neue Medikamente zu entwickeln, und ein spezifisches und standardisiertes Modell für Knorpeldefekte benötigt wird. In dieser Studie wurde ein Modell für Knorpeldefekte in voller Dicke (FTCD) erstellt, indem bei Ratten Löcher in die fetale Trochlea-Rille gebohrt wurden. Für die Modellbewertung wurden grobe Beobachtungen, Schmerzverhaltenstests und histopathologische Analysen durchgeführt. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen für kOA hat dieses Modell nur einen geringen Einfluss auf den Allgemeinzustand der Ratten. Dieser Modellierungsansatz ist zugänglich, kann gut verwaltet werden und unterstützt das Verständnis des Fortschreitens von Knorpeldefekten zu kOA und die Entwicklung wirksamer Therapeutika. Dieses Modell kann auch für die Erprobung von Therapien verwendet werden, die kOA verhindern, indem sie Defekte in präosteoarthritischen Gelenken heilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie beschreibt ein Tiermodell zur Nachahmung klinischer Knorpeldefekte durch Bohren von Löchern in die femorale Trochlea-Rille von Ratten (Ergänzende Abbildung 1). Nach einer Knorpelverletzung ist die Erregbarkeit oder Reaktionsfähigkeit peripherer Nozizeptoren erhöht, was zu einer Senkung der Schmerzschwelle und einer Verbesserung der Reaktionsfähigkeit auf Stimulation führen kann18. In präklinischen Studien hat die Modellierung von Knorpeldefekte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Zhejiang Natural Science Foundation (Fördernummer LQ20H270009), der Natural Science Foundation of China (Fördernummern 82074464 und 82104890), der Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (Fördernummern 2020ZA039, 2020ZA096 und 2022ZB137) und dem Medical Health Science and Technology Project der Gesundheitskommission der Provinz Zhejiang (Fördernummer 2016KYA196) unterstützt.
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
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