Desenvolvimento e Avaliação de um Modelo de Defeitos Cartilaginosos em Rato
Summary
Este protocolo estabelece um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de orifícios no sulco troclear femoral de ratos e mensuração do comportamento da dor e alterações histopatológicas subsequentes.
Abstract
Defeitos cartilaginosos da articulação do joelho causados por trauma são uma lesão comum na articulação esportiva na clínica, e esses defeitos resultam em dor articular, movimento prejudicado e, eventualmente, osteoartrite do joelho (kOA). No entanto, há pouco tratamento efetivo para defeitos cartilaginosos ou mesmo kOA. Modelos animais são importantes para o desenvolvimento de fármacos terapêuticos, mas os modelos existentes para defeitos cartilaginosos são insatisfatórios. Este trabalho estabeleceu um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de furos no sulco troclear femoral de ratos, e o comportamento da dor e as alterações histopatológicas subsequentes foram usados como experimentos de leitura. Após a cirurgia, o limiar de retirada mecânica foi diminuído, os condrócitos no local lesado foram perdidos, a expressão de MMP13 das metaloproteinases da matriz foi aumentada e a expressão de colágeno tipo II diminuiu, consistente com as alterações patológicas observadas nos defeitos da cartilagem humana. Essa metodologia é de fácil e simples execução e possibilita a observação macroscópica imediatamente após a lesão. Além disso, este modelo pode mimetizar com sucesso defeitos clínicos da cartilagem, fornecendo uma plataforma para o estudo do processo patológico dos defeitos cartilaginosos e desenvolvimento de drogas terapêuticas correspondentes.
Introduction
A cartilagem articular é um tecido altamente diferenciado e denso, constituído por condrócitos e matrizextracelular1. A camada superficial da cartilagem articular é uma forma de cartilagem hialina, que apresenta superfície lisa, baixo atrito, boa resistência e elasticidade e excelente tolerância ao estressemecânico2. A matriz extracelular é composta por proteoglicanos e água, sendo o colágeno tipo II o principal componente estrutural do colágeno, sendo responsável por cerca de 90% do colágeno total3. Como não existem vasos sanguíneos ou nervos no tecido cartilaginoso, este não tem a capacidade de auto-reparação após a lesão4. Portanto, os defeitos cartilaginosos causados por trauma sempre foram uma doença articular intratável na clínica; Além disso, essa doença articular tende a atingir os jovens, e a incidência mundial estáaumentando5,6. A articulação do joelho é o local mais comum de defeitos cartilaginosos, e os defeitos são acompanhados por dor articular, disfunção articular e degeneração da cartilagem articular, eventualmente levando à osteoartrite do joelho (kOA)7. Os defeitos cartilaginosos da articulação do joelho acarretam ônus econômico e fisiológico aos pacientes e afetam seriamente a qualidade de vida dospacientes8. Esta doença representa um grande e urgente desafio clínico sem soluções iminentes. Atualmente, a cirurgia é a base do tratamento dos defeitos da cartilagem, mas seu resultado a longo prazo permaneceinsatisfatório9.
Defeitos clínicos da cartilagem eventualmente levam à kOA e, portanto, modelos animais de kOA são comumente usados para o estudo patológico de defeitos cartilaginosos e desenvolvimento de drogas. O estabelecimento de modelos animais é importante para o entendimento do processo fisiopatológico do reparo do defeito cartilaginoso, que pode ser utilizado para observar a regeneração cartilaginosa e a alteração entre fibrocartilagem e cartilagemhialina10. No entanto, modelos animais comumente utilizados, como modelos cirúrgicos de transecção do ligamento cruzado anterior (LTCA), desestabilização do menisco medial (DMM), ooforectomia (OVX) e Hulth, geralmente necessitam de modelagem em longo prazo e permitem apenas avaliações patológicas e da dor, o que impõe limitações à eficiência do desenvolvimento de fármacos11. Além dos modelos cirúrgicos, modelos químicos, como monoiodoacetato (MIA) e injeção de papaína, também resultam em defeitos cartilaginosos, mas o grau do defeito não pode ser bem manejado e as condições estão distantes da realidade clínica11. A colisão é outra abordagem para modelar defeitos de cartilagem em animais maiores, mas esse método depende do uso de instrumentos específicos e raramente é aplicado12.
Em resumo, os modelos de kOA existentes não são ideais para estudar a patogênese de defeitos cartilaginosos ou desenvolver novas drogas, sendo necessário um modelo específico e padronizado para defeitos cartilaginosos. Este estudo estabeleceu um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de furos no sulco troclear femoral em ratos. Observação macroscópica, testes de comportamento da dor e análise histopatológica foram realizados para avaliação do modelo. Ao contrário de outros modelos animais de kOA, este modelo tem pouco efeito sobre o estado geral dos ratos. Essa abordagem de modelagem é acessível, pode ser bem gerenciada e apoia a compreensão da progressão de defeitos cartilaginosos para kOA e o desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Esse modelo também pode ser usado para testar terapias que previnem a kOA por meio da cicatrização de defeitos em articulações pré-osteoartríticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo descreve um modelo animal para mimetizar defeitos clínicos da cartilagem por meio de furos no sulco troclear femoral de ratos (Figura 1 Suplementar). Após a lesão da cartilagem, a excitabilidade ou responsividade dos nociceptores periféricos é aumentada, o que pode resultar em diminuição do limiar de dor e aumento da responsividade à estimulação18. Em estudos pré-clínicos, a modelagem de defeitos cartilaginosos em diferentes espécies de an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang (número de concessão LQ20H270009), a Fundação de Ciências Naturais da China (números de concessão 82074464 e 82104890), a Fundação de Ciências Médicas Chinesas Tradicionais de Zhejiang (números de concessão 2020ZA039, 2020ZA096 e 2022ZB137) e o Projeto de Ciência e Tecnologia em Saúde Médica da Comissão Provincial de Saúde de Zhejiang (número de concessão 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
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