פיתוח והערכה של מודל חולדה של פגמים בסחוס בעובי מלא
Summary
פרוטוקול זה מבסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות ומדידת התנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים הבאים.
Abstract
פגמים בסחוס של מפרק הברך הנגרמים כתוצאה מטראומה הם פציעת מפרק ספורט נפוצה במרפאה, ופגמים אלה גורמים לכאבי מפרקים, לפגיעה בתנועה ובסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA). עם זאת, אין כמעט טיפול יעיל לפגמים בסחוס או אפילו kOA. מודלים של בעלי חיים חשובים לפיתוח תרופות טיפוליות, אך המודלים הקיימים לפגמים בסחוס אינם מספקים. עבודה זו ביססה מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות, והתנהגות הכאב והשינויים ההיסטופתולוגיים שלאחר מכן שימשו כניסויי קריאה. לאחר הניתוח, סף הנסיגה המכנית ירד, כונדרוציטים באתר הפגוע אבדו, ביטוי מטריצה metalloproteinase MMP13 הוגדל, ביטוי קולגן מסוג II ירד, בהתאם לשינויים הפתולוגיים שנצפו פגמים בסחוס האנושי. מתודולוגיה זו קלה ופשוטה לביצוע ומאפשרת התבוננות גסה מיד לאחר הפציעה. יתר על כן, מודל זה יכול לחקות בהצלחה פגמים בסחוס הקליני, ובכך לספק פלטפורמה לחקר התהליך הפתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות טיפוליות מתאימות.
Introduction
סחוס מפרקי הוא רקמה מובחנת וצפופה מאוד המורכבת מכונדרוציטים ומטריקס חוץ-תאי1. שכבת פני השטח של הסחוס המפרקי היא סוג של סחוס היאלין, בעל משטח חלק, חיכוך נמוך, חוזק וגמישות טובים, וסובלנות מאמץ מכנית מעולה2. המטריצה החוץ-תאית כוללת קולגן פרוטאוגליקן ומים, וקולגן מסוג II הוא המרכיב המבני העיקרי של הקולגן, שכן הוא מהווה כ-90% מכלל קולגן3. מכיוון שלא קיימים כלי דם או עצבים ברקמת הסחוס, אין לו יכולת לתקן את עצמו לאחר פציעה4. לכן, פגמים בסחוס שנגרמו כתוצאה מטראומה היו מאז ומתמיד מחלת מפרקים בלתי פתירה במרפאות; בנוסף, מחלה משותפת זו נוטה להכות צעירים, ואת השכיחות העולמית היא בעלייה 5,6. מפרק הברך הוא האתר השכיח ביותר של פגמים בסחוס, והפגמים כאן מלווים בכאבי מפרקים, תפקוד לקוי של המפרקים וניוון סחוס מפרקי, מה שמוביל בסופו של דבר לדלקת מפרקים ניוונית בברך (kOA)7. פגמים בסחוס במפרק הברך יוצרים עומס כלכלי ופיזיולוגי על המטופלים ומשפיעים קשות עלאיכות חייהם 8. מחלה זו מציבה אתגר קליני גדול ודחוף ללא פתרונות קרובים. כיום, ניתוח הוא עמוד התווך של הטיפול בפגמים בסחוס, אך תוצאותיו ארוכות הטווח אינן משביעות רצון9.
פגמים קליניים בסחוס מובילים בסופו של דבר ל-kOA, ולכן מודלים של בעלי חיים kOA משמשים בדרך כלל למחקר פתולוגי של פגמים בסחוס ופיתוח תרופות. הקמת מודלים של בעלי חיים חשובה להבנת התהליך הפתופיזיולוגי של תיקון פגמים בסחוס, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לצפות בהתחדשות הסחוס ובשינוי בין סחוס פיברוקרטי לסחוס היאלין10. עם זאת, מודלים נפוצים של kOA בבעלי חיים, כגון מודלים כירורגיים של טרנסקציה של הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT), ערעור יציבות המניסקוס המדיאלי (DMM), כריתת שחלות (OVX) והולת’, זקוקים בדרך כלל למודלים ארוכי טווח ומאפשרים רק הערכות פתולוגיות וכאב, מה שמציב מגבלות על יעילות פיתוח התרופות11. מלבד המודלים הניתוחיים, מודלים כימיים, כגון מונויודואצטט (MIA) והזרקת פפאין, גורמים גם הם לפגמים בסחוס, אך לא ניתן לנהל היטב את מידת הפגם, והתנאים רחוקים מהמציאות הקלינית11. התנגשות היא גישה נוספת למדל פגמים בסחוס בבעלי חיים גדולים יותר, אך שיטה זו תלויה בשימוש במכשירים ספציפיים ומיושמת לעיתים רחוקות12.
לסיכום, המודלים הקיימים של kOA אינם אידיאליים לחקר הפתוגנזה של פגמים בסחוס או לפיתוח תרופות חדשות, ויש צורך במודל ספציפי וסטנדרטי לפגמים בסחוס. מחקר זה ביסס מודל פגמים בסחוס בעובי מלא (FTCD) על ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך בחולדות. נערכו תצפית גסה, מבחני התנהגות כאב וניתוח היסטופתולוגי להערכת מודל. שלא כמו מודלים אחרים של בעלי חיים של kOA, למודל זה יש השפעה מועטה בלבד על מצבן הכללי של החולדות. גישת מידול זו נגישה, ניתנת לניהול טוב ותומכת בהבנת ההתקדמות מפגמים בסחוס ל- kOA ופיתוח טיפולים יעילים. מודל זה יכול לשמש גם לבדיקת טיפולים המונעים kOA על ידי ריפוי פגמים במפרקים טרום אוסטיאוארתריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מתאר מודל של בעלי חיים לחיקוי פגמים בסחוס קליני על-ידי קידוח חורים בחריץ טרוכלארי הירך של חולדות (איור משלים 1). לאחר פגיעה בסחוס, ההתרגשות או ההיענות של nociceptors היקפי משופר, אשר יכול לגרום לירידה בסף הכאב ואת שיפור ההיענות לגירוי18. במחקרים פרה-קליניים, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של ג’ג’יאנג (מענק מספר LQ20H270009), הקרן למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 82074464 ו-82104890), הקרן למדעי הרפואה הסינית המסורתית של ג’ג’יאנג (מספרי מענקים 2020ZA039, 2020ZA096 ו-2022ZB137) ופרויקט מדע וטכנולוגיה של בריאות רפואית של ועדת הבריאות המחוזית של ג’ג’יאנג (מענק מספר 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
