Desarrollo y evaluación de un modelo de rata de defectos de cartílago de espesor total
Summary
Este protocolo establece un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de orificios en el surco troclear femoral de ratas y la medición del comportamiento del dolor posterior y los cambios histopatológicos.
Abstract
Los defectos del cartílago de la articulación de la rodilla causados por un traumatismo son una lesión común de las articulaciones deportivas en la clínica, y estos defectos provocan dolor en las articulaciones, deterioro del movimiento y, finalmente, osteoartritis de rodilla (kOA). Sin embargo, existe poco tratamiento eficaz para los defectos del cartílago o incluso para el kOA. Los modelos animales son importantes para el desarrollo de fármacos terapéuticos, pero los modelos existentes para los defectos del cartílago no son satisfactorios. Este trabajo estableció un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de orificios en el surco troclear femoral de ratas, y el comportamiento del dolor posterior y los cambios histopatológicos se utilizaron como experimentos de lectura. Después de la cirugía, el umbral de retirada mecánica disminuyó, se perdieron condrocitos en el sitio lesionado, se aumentó la expresión de MMP13 de la metaloproteinasa de matriz y disminuyó la expresión de colágeno tipo II, lo que es consistente con los cambios patológicos observados en los defectos del cartílago humano. Esta metodología es fácil y sencilla de realizar y permite la observación macroscópica inmediatamente después de la lesión. Además, este modelo puede imitar con éxito los defectos clínicos del cartílago, proporcionando así una plataforma para estudiar el proceso patológico de los defectos del cartílago y desarrollar los fármacos terapéuticos correspondientes.
Introduction
El cartílago articular es un tejido muy diferenciado y denso formado por condrocitos y matriz extracelular1. La capa superficial del cartílago articular es una forma de cartílago hialino, que tiene una superficie lisa, baja fricción, buena resistencia y elasticidad, y excelente tolerancia al estrés mecánico2. La matriz extracelular está compuesta por proteoglicanos de colágeno y agua, y el colágeno tipo II es el principal componente estructural del colágeno, ya que representa alrededor del 90% del colágeno total3. Como no existen vasos sanguíneos ni nervios en el tejido cartilaginoso, carece de la capacidad de autorrepararse después deuna lesión. Por lo tanto, los defectos del cartílago causados por traumatismos siempre han sido una enfermedad articular intratable en las clínicas; Además, esta enfermedad articular tiende a afectar a los jóvenes, y la incidencia mundial va en aumento 5,6. La articulación de la rodilla es el sitio más común de defectos del cartílago, y los defectos aquí se acompañan de dolor articular, disfunción articular y degeneración del cartílago articular, lo que eventualmente conduce a la osteoartritis de rodilla (kOA)7. Los defectos del cartílago de la articulación de la rodilla suponen cargas económicas y fisiológicas para los pacientes y afectan gravemente a la calidad de vida de los pacientes8. Esta enfermedad supone un reto clínico importante y urgente sin soluciones inminentes. En la actualidad, la cirugía es el pilar del tratamiento de los defectos del cartílago, pero su resultado a largo plazo sigue siendo insatisfactorio9.
Los defectos clínicos del cartílago eventualmente conducen a kOA y, por lo tanto, los modelos animales de kOA se usan comúnmente para el estudio patológico de los defectos del cartílago y el desarrollo de fármacos. El establecimiento de modelos animales es importante para comprender el proceso fisiopatológico de reparación de defectos cartilaginosos, que pueden ser utilizados para observar la regeneración del cartílago y la alteración entre el fibrocartílago y el cartílago hialino10. Sin embargo, los modelos animales de kOA comúnmente utilizados, como los modelos quirúrgicos de transección del ligamento cruzado anterior (ACLT), desestabilización del menisco medial (DMM), ovariectomía (OVX) y Hulth, generalmente necesitan modelos a largo plazo y solo permiten evaluaciones patológicas y de dolor, lo que plantea limitaciones a la eficiencia del desarrollo de fármacos11. Además de los modelos quirúrgicos, los modelos químicos, como el monoyodoacetato (MIA) y la inyección de papaína, también resultan en defectos del cartílago, pero el grado del defecto no puede ser bien manejado y las condiciones están lejos de la realidad clínica11. La colisión es otro enfoque para modelar defectos del cartílago en animales más grandes, pero este método depende del uso de instrumentos específicos y rara vez se aplica12.
En resumen, los modelos de kOA existentes no son ideales para estudiar la patogénesis de los defectos del cartílago o desarrollar nuevos fármacos, y se necesita un modelo específico y estandarizado para los defectos del cartílago. Este estudio estableció un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de agujeros en el surco troclear femoral en ratas. Para la evaluación del modelo se realizó observación macroscópica, pruebas de comportamiento al dolor y análisis histopatológico. A diferencia de otros modelos animales de kOA, este modelo tiene poco efecto en el estado general de las ratas. Este enfoque de modelado es accesible, se puede manejar bien y apoya la comprensión de la progresión de los defectos del cartílago a kOA y el desarrollo de terapias efectivas. Este modelo también se puede utilizar para probar terapias que previenen la kOA mediante la curación de defectos en las articulaciones preartríticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio describe un modelo animal para imitar defectos clínicos del cartílago mediante la perforación de agujeros en el surco troclear femoral de ratas (Figura suplementaria 1). Después de la lesión del cartílago, la excitabilidad o capacidad de respuesta de los nociceptores periféricos aumenta, lo que puede resultar en una disminución en el umbral del dolor y la mejora de la capacidad de respuesta a la estimulación18. En estudios preclínicos, el mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang (subvención número LQ20H270009), la Fundación de Ciencias Naturales de China (subvención números 82074464 y 82104890), la Fundación de Ciencias Médicas Tradicionales Chinas de Zhejiang (subvenciones números 2020ZA039, 2020ZA096 y 2022ZB137) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Salud Médica de la Comisión Provincial de Salud de Zhejiang (subvención número 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
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