Summary
Dit protocol stelt een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen te meten.
Abstract
Kraakbeendefecten van het kniegewricht veroorzaakt door trauma zijn een veel voorkomende sportgewrichtsblessure in de kliniek, en deze defecten resulteren in gewrichtspijn, verminderde beweging en uiteindelijk knieartrose (kOA). Er is echter weinig effectieve behandeling voor kraakbeendefecten of zelfs kOA. Diermodellen zijn belangrijk voor het ontwikkelen van therapeutische geneesmiddelen, maar de bestaande modellen voor kraakbeendefecten zijn onbevredigend. Dit werk stelde een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten, en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen werden gebruikt als uitleesexperimenten. Na de operatie werd de mechanische ontwenningsdrempel verlaagd, chondrocyten op de gewonde plaats gingen verloren, de matrixmetalloproteinase MMP13-expressie was verhoogd en de collageenexpressie van type II nam af, in overeenstemming met de pathologische veranderingen die werden waargenomen in menselijke kraakbeendefecten. Deze methodologie is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren en maakt grove observatie onmiddellijk na het letsel mogelijk. Bovendien kan dit model met succes klinische kraakbeendefecten nabootsen, waardoor het een platform biedt voor het bestuderen van het pathologische proces van kraakbeendefecten en het ontwikkelen van overeenkomstige therapeutische geneesmiddelen.
Introduction
Gewrichtskraakbeen is een sterk gedifferentieerd en dicht weefsel bestaande uit chondrocyten en extracellulaire matrix1. De oppervlaktelaag van gewrichtskraakbeen is een vorm van hyalien kraakbeen, met een glad oppervlak, lage wrijving, goede sterkte en elasticiteit en een uitstekende mechanische spanningstolerantie2. De extracellulaire matrix bestaat uit collageen proteoglycaan en water, en type II collageen is de belangrijkste structurele component van het collageen, omdat het goed is voor ongeveer 90% van het totale collageen3. Omdat er geen bloedvaten of zenuwen in kraakbeenweefsel aanwezig zijn, mist het het vermogen om zichzelf te herstellen na een verwonding4. Daarom zijn kraakbeendefecten veroorzaakt door trauma altijd een hardnekkige gewrichtsaandoening geweest in klinieken; Bovendien heeft deze gewrichtsziekte de neiging om jonge mensen te treffen, en de wereldwijde incidentie neemt toe 5,6. Het kniegewricht is de meest voorkomende plaats van kraakbeendefecten en defecten gaan hier gepaard met gewrichtspijn, gewrichtsdisfunctie en gewrichtskraakbeendegeneratie, wat uiteindelijk leidt tot knieartrose (kOA)7. Kraakbeendefecten van het kniegewricht brengen economische en fysiologische belastingen met zich mee voor patiënten en tasten de kwaliteit van leven van de patiënt ernstig aan8. Deze ziekte vormt een grote en urgente klinische uitdaging zonder op handen zijnde oplossingen. Momenteel is chirurgie de steunpilaar van de behandeling van kraakbeendefecten, maar het resultaat op lange termijn blijft onbevredigend9.
Klinische kraakbeendefecten leiden uiteindelijk tot kOA en daarom worden kOA-diermodellen vaak gebruikt voor de pathologische studie van kraakbeendefecten en medicijnontwikkeling. Het opstellen van diermodellen is belangrijk voor het begrijpen van het pathofysiologische proces van kraakbeendefectherstel, dat kan worden gebruikt om de kraakbeenregeneratie en de verandering tussen fibrokraakbeen en hyalien kraakbeen te observeren10. Veelgebruikte kOA-diermodellen, zoals chirurgische modellen van voorste kruisbandtranssectie (ACLT), destabilisatie van de mediale meniscus (DMM), ovariëctomie (OVX) en Hulth, hebben echter meestal langetermijnmodellering nodig en maken alleen pathologische en pijnevaluaties mogelijk, wat beperkingen oplegt aan de efficiëntie van de ontwikkeling van geneesmiddelen11. Naast de chirurgische modellen resulteren chemische modellen, zoals monoiodoacetaat (MIA) en papaïne-injectie, ook in kraakbeendefecten, maar de mate van het defect kan niet goed worden beheerd en de omstandigheden zijn ver verwijderd van de klinische realiteit11. Botsing is een andere benadering om kraakbeendefecten bij grotere dieren te modelleren, maar deze methode is afhankelijk van het gebruik van specifieke instrumenten en wordt zelden toegepast12.
Kortom, de bestaande kOA-modellen zijn niet ideaal voor het bestuderen van de pathogenese van kraakbeendefecten of het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen, en een specifiek en gestandaardiseerd model voor kraakbeendefecten is nodig. Deze studie stelde een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef bij ratten. Grove observatie, pijngedragstests en histopathologische analyse werden uitgevoerd voor modelevaluatie. In tegenstelling tot andere diermodellen van kOA heeft dit model weinig effect op de algemene toestand van de ratten. Deze modelleringsbenadering is toegankelijk, kan goed worden beheerd en ondersteunt het begrip van progressie van kraakbeendefecten naar kOA en de ontwikkeling van effectieve therapieën. Dit model kan ook worden gebruikt voor het testen van therapieën die kOA voorkomen door defecten in pre-artrosegewrichten te genezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden goedgekeurd door de Medische Normen en Ethische Commissie van de Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, die voldoet aan de Chinese wetgeving inzake het gebruik en de verzorging van proefdieren. In de huidige studie werden 6 weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten met een gewicht van 150-180 g gebruikt. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie de Tabel van Materialen).
1. Vaststelling van een model met kraakbeendefecten van volledige dikte bij ratten
- Na 1 week acclimatisatie aan de nieuwe omgeving, willekeurig en gelijkelijk verdelen de ratten in twee groepen (n = 8 ratten / groep). De ratten in de schijngroep zullen de schijnoperatie ondergaan, terwijl de ratten in de modelgroep de experimentele operatie zullen ondergaan waarbij gaten in de femorale trochleaire groef worden geboord.
OPMERKING: Elke kooi moet worden bedekt met steriele maïskolfvullingen (zie de tabel met materialen) om de tenen van de ratten te beschermen. - Verdoof de ratten door een intraperitoneale injectie (i.p.) van pentobarbitalnatrium (40 mg/kg). Druk vervolgens zachtjes op de tenen van de ratten om adequate anesthesie te bevestigen. Gebruik een dierenartszalf op de ogen van de ratten om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
OPMERKING: De dierchirurgie moet worden uitgevoerd in een speciale operatiekamer met behulp van chirurgische instrumenten met autoclaaf. De operators moeten schone laboratoriumjassen, gezichtsmaskers, hoofdbedekkingen en steriele handschoenen dragen tijdens de operatie. Plaats steriele pads over het operatiegebied en steriliseer alle apparatuur voor gebruik. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens de hele procedure. - Plaats de rat op de operatietafel in rugligging, scheer de linker- en rechterachterpoten en reinig het kniegewricht met chirurgische zeep, gevolgd door afwisselend antiseptische povidon-jodiumoplossing en alcohol driemaal onder steriele omstandigheden. Plaats een steriel gordijn over de rat en stel alleen het gedesinfecteerde kniegewricht bloot.
- Maak een incisie van 1 cm met een scalpelblad (nummer 11) in het midden van het kniegewricht van de rat van boven naar beneden en snijd het gewrichtskapsel en de quadriceps femorispees langs de mediale rand van de patella na de oppervlakkige dissectie.
OPMERKING: De quadriceps femoris pees is bevestigd aan de patella en aan de femorale condylus tijdens de flexie van het kniegewricht13. De groef in het gewrichtskapsel is de femorale trochleaire groef en de distale femorale condylus vormt de mediale en laterale condylen. - Draai de patella naar buiten en buig het scheenbeen en het kuitbeen in een hoek van 90° om de trochlea van de femorale condylus volledig bloot te leggen. Gebruik een cirkelvormige boor met een diameter van 1,6 mm (zie de materiaaltabel) verticaal op het kraakbeenoppervlak bij 4.000 tpm gedurende 10 s om één kraakbeendefect van volledige dikte in de femorale trochleaire groef met een diepte van 0,1 mm te maken.
OPMERKING: Gebruik zoutoplossing met tussenpozen om thermisch trauma aan het omliggende botweefsel tijdens de boorprocedure te minimaliseren. - Veeg de operatieplaats af met wattenbollen gedrenkt in een zoutoplossing van 0,9%, vervang de patella, houd de knie in een extensiepositie en hecht de incisie laag voor laag met niet-absorbeerbare 4-0 hechtingen (zie Tabel met materialen).
- Plaats de dieren op verwarmingskussens met sternale lighouding, controleer ze totdat ze wakker worden en breng ze vervolgens terug naar hun kooien. Injecteer buprenorfine (0,05 mg/kg) driemaal na de operatie om de 8 uur subcutaan voor pijnverlichting.
- Test het pijngerelateerde gedrag van alle ratten op 3 dagen, 10 dagen en 17 dagen na de operatie, zoals beschreven in rubriek 2.
2. Mechanische ophouddrempel (MWT)
OPMERKING: De MWT van de bilaterale achterste plantaar van ratten werd gemeten met de klassieke von Frey filamentpijnmeetmethode14.
- Plaats de rat in een enkele plastic kamer (17 cm x 11 cm x 13 cm) op een gaasplatform (zie de materiaaltabel) en plaats de gaasbasis 50 cm boven een tafel. Meet de MWT na 30 minuten aanpassing.
- Druk het von Frey-filament (zie de tabel met materialen) loodrecht op het plantaire oppervlak van de achterpoot van elke rat en buig de borstel ongeveer 2 s, waarbij het dikste deel van het midden van de achterpoot wordt vermeden.
- Verhoog geleidelijk het stimulusgewicht van de laagste 4 g totdat een positieve reactie (pootterugtrekking of pootlikken) optreedt.
OPMERKING: Het interval tussen elke stimulatie moet meer dan 1 minuut zijn. De MWT wordt gedefinieerd als drie positieve reacties in vijf stimulaties; Noteer het stimulusgewicht in grammen. - Bereken de gemiddelde waarden voor de sham- en modelgroepen op basis van het geregistreerde minimale stimulusgewicht in grammen.
3. Histopathologische en immunohistochemische analyse
- Verdoof de ratten 17 en 56 dagen na de operatie met een 40 mg/kg pentobarbitalnatrium (i.p.) en offer alle ratten op door bloed uit het hart te halen. Isoleer de knieën door het bot in het midden- en middenscheenbeen te snijden en ontleed het omliggende spierweefsel. Verwijder de kniegewrichten voor histologische analyse.
- Bevestig de kniegewrichten gedurende 48 uur bij kamertemperatuur in 20 ml 10% paraformaldehyde-oplossing en ontkalk ze vervolgens met 20 ml 10% EDTA-oplossing in een orbitale shaker gedurende 8 weken bij 4 °C. Verander de EDTA-oplossing elke dag.
- Trim het kniegewricht zodat het past bij de grootte van de insluitdoos. Integreer de uitgedroogde kniegewrichten in 100% paraffine15.
- Plaats de in paraffine ingebedde kniegewrichten op de houder van een microtoom, pas de hoek aan en snijd het paraffinemonster bij met een mes totdat het oppervlak vlak is.
- Stel de dikte van de paraffineplakken in op 3 μm en druk de plakjes plat in een waterbad bij 40 °C.
- Plak de plakjes op glasplaten, leg ze in een bakmachine van 45 °C (zie de materiaaltabel) tot ze droog zijn en bewaar ze bij kamertemperatuur.
- Dewaxen en rehydratie: Dewax de plakjes in een oven op 60 °C gedurende 4 uur en plaats de plakjes vervolgens achtereenvolgens in 100% xyleen (drie keer), 100% ethanol (twee keer), 95% ethanol, 80% ethanol en 75% ethanol gedurende 5 minuten elke keer.
- Hematoxyline en eosine (H &E) kleuring
- Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
- Bevlek de plakjes met 0,5% hematoxyline (zie materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen hematoxylineresidu op de plakoppervlakken zit.
- Dompel de plakjes gedurende 3 s onder in 1% zoutzuuralcohol en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Week de plakjes 10 s in 1% ammoniakwater en was de plakjes 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Bevlek de plakjes met eosine (zie materiaaltabel) gedurende 1 minuut en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen eosineresidu op de plakjes zit.
- Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
- Voeg een druppel neutrale hars (zie Tabel met materialen) toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
- Safranin O/Fast Freen (SO) kleuring
- Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
- Bevlek de plakjes met 0,05% Fast Green (zie de Materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen Fast Green-residu op het oppervlak van de plakjes zit.
- Dompel de plakjes gedurende 10 s onder in 1% azijnzuuroplossing en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Bevlek de plakjes met 2,5% SO (zie materiaaltabel) gedurende 2 minuten en was de plakjes vervolgens met dubbel gedestilleerd water totdat er geen SO-residu op de snijoppervlakken zit.
- Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
- Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
- Toluidine blauw (TB) kleuring
- Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
- Dompel de plakjes gedurende 2 minuten onder in een 1% TB-oplossing (zie de materiaaltabel) en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen toluïdineblauw residu op het oppervlak van de plakjes zit.
- Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
- Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
- Masson kleuring
- Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
- Voeg Bouin-oplossing (zie de Materiaaltabel) druppelsgewijs toe aan de plakjes, kleur ze gedurende 2 uur op 37 °C en was ze met dubbel gedestilleerd water totdat de gele kleur op het oppervlak van de plakjes verdwijnt.
- Bevlek de plakjes met celestietblauw (zie de materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen celestietblauwe resten op de plakjes zitten.
- Bevlek de plakjes met hematoxyline gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen hematoxylineresidu op de plakoppervlakken zit.
- Dompel de plakjes 5 s onder in zure ethanol en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Bevlek de plakjes met Ponceau fuchsin (zie de Tabel met materialen) gedurende 10 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen Ponceau fuchsin-residu op de plakjes zit.
- Dompel de plakjes gedurende 10 minuten onder in fosfemomedisch zuur (zie de tabel met materialen), dompel ze vervolgens gedurende 5 minuten onder in tbc-oplossing en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen tbc-residu op het oppervlak van de plakjes zit.
- Dompel de plakjes gedurende 2 minuten onder in een zwakzure oplossing en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Dompel de plakjes onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer) achtereenvolgens gedurende 1 minuut per keer.
- Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
- Observeer alle plakjes onder een microscoop in een dubbelblinde omgeving om de mate van gewrichtskraakbeendegeneratie te bepalen volgens het scoresysteem van Mankin16.
- Immunohistochemie
- Dewax en rehydrateer de plakjes routinematig en was de plakjes met PBS gedurende 2 minuten.
- Dompel de plakjes onder in natriumcitraatoplossing en plaats de plakjes gedurende 4 uur in een oven op 60 °C om het antigeen te herstellen. Was de plakjes met PBS drie keer gedurende 3 minuten elk.
- Dompel de plakjes gedurende 10 minuten onder in een 0,3% Triton X-100-oplossing en was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Blokkeer de endogene peroxidase-activiteit door gedurende 30 minuten een 3% H 2 O2-oplossingin methanol bij kamertemperatuur toe te voegen. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Incubeer de secties met 5% geitenserum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om eventuele niet-specifieke binding te blokkeren. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Voeg 100 μL PBS-verdunde primaire antilichamen (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; en anti-MMP13, 1:100; zie de tabel met materialen) toe aan elke plak en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Incubeer elke plak met 100 μL PBS-verdund (1:100) secundair antilichaam (geitenantikonijn of geitenantimuis, zie de materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
- Voeg 100 μL 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB, zie de tabel met materialen) werkoplossing toe aan elke plak.
- Observeer en registreer de verschijningstijd van een bruine kleur onder een microscoop; De chromogene reactie maakt de epitoopplaatsen bruin17. Behandel de rest van de monsters met dezelfde geregistreerde reactietijd.
- Nadat de plakjes bruin zijn geworden, was je de plakjes twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende telkens 3 minuten.
- Bevlek de plakjes opnieuw met hematoxyline gedurende 1 minuut en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Dompel de plakjes 3 s onder in zoutzuur en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Week de plakjes 10 s in 1% ammoniakwater en was de plakjes 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
- Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
- Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit werk werd een rattenmodel van FTCD vastgesteld door gaten in de femorale trochleaire groef te boren en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen te detecteren. Zoals te zien is in figuur 1, was 3 dagen na modellering, vergeleken met de schijngroep, de MWT van ratten in de modelgroep significant verminderd, wat wijst op hyperalgesie veroorzaakt door de FTCD. 17 dagen na het modelleren bleef de mechanische ontwenningsdrempel van de ratten in de modelgroep op een laag niveau, wat aangeeft dat de pijnsensibilisatie minstens 17 dagen kon duren. De histopathologische kleuringsresultaten toonden aan dat in de schijngroep de structuur van het gewrichtskraakbeen duidelijk was, het kraakbeenoppervlak intact was, de chondrocyten gelijkmatig verdeeld waren en type II collageen sterk tot expressie kwam. Integendeel, in de modelgroep vormde het kraakbeenoppervlak een depressie, gingen de chondrocyten verloren, nam de expressie van matrixmetalloproteinase MMP13 toe en nam de expressie van type II-collageen af (figuur 2 en figuur 3).
Figuur 1: Ontwikkeling van MWT na kraakbeendefecten. Mechanische onttrekkingsdrempels van de achterpoten werden beoordeeld nadat kraakbeendefecten waren geïnduceerd. n = 8 ratten/groep. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. **P < 0,01 versus sham-groep, ***P < 0,001 versus sham-groep. Er werd een Student's t-test uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histopathologische observatie (HE, SO, TB en Masson kleuring) en Mankin's score van de kniegewrichten van de rat op dag 17 na de behandeling met kraakbeendefecten. (A) Representatieve histologische beelden van een FTCD-rat. De zwarte pijlen geven de kraakbeendefecten aan. Schaalbalk = 200 μm. (B) Statistische analyse van de artrosescores in de sham- en modelgroepen. n = 6 ratten/groep. Waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. ***P < 0,001 versus sham-groep. Er werd een Student's t-test uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunohistochemische observatie van de expressie van Col1, Col3, Col2 en MMP13 en negatieve kleuring in het kraakbeen van de rat op dag 17. Representatieve histologische foto's van een FTCD-rat. De zwarte pijlen geven de kraakbeendefecten aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve beelden van het induceren van kraakbeendefecten van volledige dikte door boren in de femorale trochleaire groef van de rat. (A) Schijnrat. (B) Model rat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Histologische evaluatie van de volledige vulling van de kraakbeendefecten van volledige dikte bij ratten. (A) Een representatief beeld op dag 17. (B) Een representatief beeld op dag 56. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschrijft een diermodel voor het nabootsen van klinische kraakbeendefecten door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten (aanvullende figuur 1). Na kraakbeenletsel wordt de prikkelbaarheid of responsiviteit van perifere nociceptoren verbeterd, wat kan resulteren in een verlaging van de pijngrens en de verbetering van de responsiviteit op stimulatie18. In preklinische studies heeft het modelleren van kraakbeendefecten bij verschillende diersoorten altijd pijn veroorzaakt19. Klinisch onderzoek heeft ook aangetoond dat de scores van de pain visual analog scale (VAS) van patiënten met kraakbeenletsel significant lager zijn dan die van gezonde personen20. We gebruikten het FTCD-model om het effect van de FTCD-behandeling te testen, en de resultaten toonden aan dat de afname van de MWT niet van voorbijgaande aard was en dat de MWT niet snel herstelde binnen een korte periode. Na een periode van behandeling was de MWT in de modelgroep nog steeds significant, terwijl de behandelingsgroep opgelucht was (gegevens niet getoond). Klinische werkzaamheid wordt over het algemeen beoordeeld op basis van een behandelingskuur van 1 maand, dus zelfs als herstel na een paar maanden optreedt, heeft dit geen invloed op de experimentele toepassing van dit model. Bovendien werden pathologische kleuring en immunohistochemie toegepast om kraakbeenoppervlakdefecten te observeren en de oprichting van FTCD aan te tonen.
Deze methode om FTCD te modelleren heeft de volgende voordelen: (1) de eenvoudige en eenvoudige bediening; (2) de korte modelleringstijd; (3) de hoge slagingsratio; en (4) de aanwezigheid van zichtbare progressie via grove waarneming. In tegenstelling tot andere diermodellen kan dit model gestandaardiseerd worden. De boordiepte en diameter van het FTCD-model zijn eenvoudig te regelen, wat gunstig is voor het standaardiseren van het FTCD-model en de herhaalbaarheid ervan verhoogt. Ten tweede is de diameter van het boorgat een belangrijke factor die de reparatie-efficiëntie bepaalt. Osteochondrale defecten met een diameter van 1,4 mm kunnen zichzelf spontaan herstellen, wat leidt tot falen in de juiste evaluatie van therapeutische behandelingen21. Om deze tekortkomingen te overwinnen en standaardisatie te bereiken, werden voorbereidende experimenten uitgevoerd en werd vastgesteld dat de kraakbeendefecten niet spontaan zouden herstellen tot 17 dagen na de operatie als de FTCD-operatie werd uitgevoerd op het gewrichtskraakbeenoppervlak met boorgaten met een diameter van 1, 6 mm. Na verloop van tijd vertoont de FTCD veroorzaakt door boren kraakbeenherstel en het defecte kraakbeen is grotendeels hersteld met 8 weken na de operatie (aanvullende figuur 2). Qua toepassingen zou dit model niet alleen gebruikt kunnen worden voor het bestuderen van de kraakbeendefecten veroorzaakt door kOA, maar ook voor het bestuderen van traumatische kraakbeendefecten, namelijk posttraumatische artrose22. Zelfhersteld kraakbeen vormt altijd fibrokraakbeen in plaats van hyalien kraakbeen op de gewonde plaats, en dit model kan ook geschikt zijn voor het bestuderen van de pathogenese en behandeling van kraakbeenfibrose23.
In termen van de beperkingen van dit model werd gekozen voor onvolwassen ratten, omdat kraakbeendefecten veroorzaakt door trauma in de klinische praktijk meestal voorkomen bij jonge mensen. Bij onvolgroeide ratten in het ontwikkelingsstadium van het skelet is het kraakbeen echter dunner dan dat van volwassen ratten, wat de resultaten van het experiment kan beïnvloeden24. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat het vermogen van stamcellen om te regenereren na kraakbeenschade bij volwassen muizen is verminderd in vergelijking met juveniele muizen25. We selecteerden ratten van 6 weken oud voor het experiment en deze ratten konden ook worden gebruikt om de mechanismen van stamcelherstel te observeren; Bovendien zijn de therapeutische effecten bij ratten van 6 weken oud meer uitgesproken dan bij volwassen ratten (gegevens niet getoond). We moeten ook FTCD modelleren bij oudere ratten, en er kan worden gespeculeerd dat reparatie langzamer kan zijn bij oudere ratten vanwege een verminderde stamcelregeneratieve capaciteit. Onderzoek heeft aangetoond dat het gewrichtskraakbeen rond osteochondrale defecten katabole activiteit bezit, en de expressie van IL-1β en FGF2 en een verstoring in de FGFr1 / FGFr3-balans zijn belangrijk bij het initiëren van het proces van vroege artroseziekte21. Het FTCD-model heeft echter nog steeds beperkingen bij het evalueren van pre-artrosedefectherstel. Een andere beperking van deze studie was het gebrek aan meting van MWT's na 17 dagen modelleren.
Kortom, dit model zou een ideaal en gestandaardiseerd diermodel zijn voor het nabootsen van kraakbeendefecten door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten. Dit model bootst niet alleen het voorkomen en de ontwikkeling van klinische FTCD na, maar biedt ook een betrouwbaar diermodel voor het evalueren van therapeutische behandelingen tegen FTCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Zhejiang Natural Science Foundation (subsidienummer LQ20H270009), de Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82074464 en 82104890), de Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (subsidienummers 2020ZA039, 2020ZA096 en 2022ZB137) en het Medical Health Science and Technology Project van Zhejiang Provincial Health Commission (subsidienummer 2016KYA196).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al.
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
