Summary

Utveckling och utvärdering av en råttmodell av broskdefekter i fulltjocklek

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll etablerar en FTCD-modell (full-thickness cartilage defects) genom att borra hål i lårbensspåret hos råttor och mäta efterföljande smärtbeteende och histopatologiska förändringar.

Abstract

Broskdefekter i knäleden orsakade av trauma är en vanlig idrottsledskada i kliniken, och dessa defekter resulterar i ledvärk, nedsatt rörelse och så småningom knäartros (kOA). Det finns emellertid liten effektiv behandling för broskdefekter eller till och med kOA. Djurmodeller är viktiga för att utveckla terapeutiska läkemedel, men de befintliga modellerna för broskdefekter är otillfredsställande. Detta arbete etablerade en FTCD-modell (full-thickness cartilage defects) genom att borra hål i lårbensspåret hos råttor, och det efterföljande smärtbeteendet och histopatologiska förändringar användes som avläsningsexperiment. Efter operationen sänktes den mekaniska abstinenströskeln, kondrocyter på det skadade stället förlorades, matrismetalloproteinas MMP13-uttryck ökades och kollagenuttryck av typ II minskade, i överensstämmelse med de patologiska förändringar som observerats vid humana broskdefekter. Denna metod är enkel och enkel att utföra och möjliggör grov observation omedelbart efter skadan. Dessutom kan denna modell framgångsrikt efterlikna kliniska broskdefekter, vilket ger en plattform för att studera den patologiska processen för broskdefekter och utveckla motsvarande terapeutiska läkemedel.

Introduction

Ledbrosk är en mycket differentierad och tät vävnad bestående av kondrocyter och extracellulär matris1. Ytskiktet av ledbrosk är en form av hyalinbrosk, som har en slät yta, låg friktion, god styrka och elasticitet och utmärkt mekanisk spänningstolerans2. Den extracellulära matrisen består av kollagenproteoglykan och vatten, och kollagen av typ II är den huvudsakliga strukturella komponenten i kollagenet, eftersom det står för cirka 90% av det totala kollagenet3. Eftersom inga blodkärl eller nerver finns i broskvävnad saknar den förmågan att självreparera efter skada4. Därför har broskdefekter orsakade av trauma alltid varit en svårbehandlad ledsjukdom i kliniker; Dessutom tenderar denna ledsjukdom att slå unga människor, och den globala förekomsten ökar 5,6. Knäleden är den vanligaste platsen för broskdefekter, och defekter här åtföljs av ledvärk, leddysfunktion och ledbroskdegeneration, vilket så småningom leder till knäartros (kOA)7. Broskdefekter i knäleden medför ekonomiska och fysiologiska bördor för patienterna och påverkar allvarligt patienternas livskvalitet8. Denna sjukdom utgör en stor och akut klinisk utmaning utan överhängande lösningar. För närvarande är kirurgi grundpelaren i behandlingen av broskdefekter, men dess långsiktiga resultat är fortfarande otillfredsställande9.

Kliniska broskdefekter leder så småningom till kOA, och därför används kOA-djurmodeller ofta för patologisk studie av broskdefekter och läkemedelsutveckling. Upprättandet av djurmodeller är viktigt för att förstå den patofysiologiska processen för reparation av broskdefekter, som kan användas för att observera broskregenerering och förändringen mellan fibrobrosk och hyalinbrosk10. Vanligt förekommande kOA-djurmodeller, såsom kirurgiska modeller av främre korsbandstranssektion (ACLT), destabilisering av medial menisk (DMM), ovariektomi (OVX) och Hulth, behöver dock vanligtvis långsiktig modellering och tillåter endast patologiska och smärtutvärderingar, vilket medför begränsningar för effektiviteten av läkemedelsutveckling11. Förutom de kirurgiska modellerna resulterar kemiska modeller, såsom monojodacetat (MIA) och papaininjektion, också i broskdefekter, men graden av defekten kan inte hanteras väl och förhållandena är långt ifrån den kliniska verkligheten11. Kollision är ett annat tillvägagångssätt för att modellera broskdefekter hos större djur, men denna metod beror på användningen av specifika instrument och tillämpas sällan12.

Sammanfattningsvis är de befintliga kOA-modellerna inte idealiska för att studera patogenesen av broskdefekter eller utveckla nya läkemedel, och en specifik och standardiserad modell för broskdefekter behövs. Denna studie etablerade en FTCD-modell (full-thickness cartilage defects) genom att borra hål i lårbensspåret hos råttor. Grov observation, smärtbeteendetester och histopatologisk analys utfördes för modellutvärdering. Till skillnad från andra djurmodeller av kOA har denna modell liten effekt på råttornas allmäntillstånd. Denna modelleringsmetod är tillgänglig, kan hanteras väl och stöder förståelsen av progression från broskdefekter till kOA och utvecklingen av effektiva terapier. Denna modell kan också användas för att testa terapier som förhindrar kOA genom att läka defekter i pre-osteoartritiska leder.

Protocol

Djurförsöken godkändes av Medical Standards and Ethics Committee vid Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, som överensstämmer med Kinas lagstiftning om användning och vård av försöksdjur. I den aktuella studien användes 6 veckor gamla hanråttor av typen Sprague-Dawley (SD) som vägde 150-180 g. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckningen). 1. Upprättande av en modell med broskdefekter i full tjocklek hos råttor</stro…

Representative Results

I detta arbete etablerades en råttmodell av FTCD genom att borra hål i lårbenets trochlearspår och detektera efterföljande smärtbeteende och histopatologiska förändringar. Som visas i figur 1, 3 dagar efter modellering, jämfört med skengruppen, minskade MWT hos råttor i modellgruppen signifikant, vilket tyder på hyperalgesi orsakad av FTCD. Vid 17 dagar efter modellering förblev den mekaniska uttagströskeln för råttorna i modellgruppen på en låg nivå, vilket indikerar att …

Discussion

Denna studie beskriver en djurmodell för att efterlikna kliniska broskdefekter genom att borra hål i lårbensspåret hos råttor (kompletterande figur 1). Efter broskskada förbättras excitabiliteten eller lyhördheten hos perifera nociceptorer, vilket kan resultera i en minskning av smärtgränsen och förbättring av respons på stimulering18. I prekliniska studier har modellering av broskdefekter hos olika djurarter alltid orsakat smärta19…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av Zhejiang Natural Science Foundation (bidragsnummer LQ20H270009), Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 82074464 och 82104890), Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (bidragsnummer 2020ZA039, 2020ZA096 och 2022ZB137) och Medical Health Science and Technology Project of Zhejiang Provincial Health Commission (bidragsnummer 2016KYA196).

Materials

3, 3 '-diaminobenzidine   Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9019 The dye for IHC staining
Anti-Collagen III antibody Novus NB600-594 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen II antibody Abcam (UK) 34712 Primary antibody for IHC
Anti-Collagen I antibody Novus NB600-408 Primary antibody for IHC
Bouin solution Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Celestite blue Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Corncob paddings   Xiaohe Technology Co., Ltd  Bedding for animal 
Eosin Sigma-Aldrich 861006 The dye for HE staining
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 The dye for SO staining
Goat anti-mouse antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9002 Secondary antibody for IHC
Goat anti-rabbit antibody ZSGQ-BIO (Beijing, China) PV-9001 Secondary antibody for IHC
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3163 The dye for HE staining
Masson Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Microdrill Rwd Life Science Co., Ltd 78001 Equipment for surgery
MMP13 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) 69926 Primary antibody for IHC
Modular tissue embedding center Thermo Fisher Scientific (USA) EC 350 Produce paraffin blocks
Neutral resin Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9555 Seal for IHC
Nonabsorbable suture Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. 4-0 Equipment for surgery
Pentobarbital sodium  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. WBBTN5G Anesthetized animal
phosphomolybdic acid  Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Ponceau fuchsin Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. R20381 The dye for Masson staining
Rotary and Sliding Microtomes Thermo Fisher Scientific (USA) HM325 Precise paraffin sections
Safranin-O Sigma-Aldrich S2255 The dye for SO staining
Scalpel blade Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. 11 Equipment for surgery
Sodium citrate solution (20x) Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. HK1222 Antigen retrieval for IHC
Sprague Dawley (SD) rats  Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. SD Experimental animal
Tissue-Tek VIP 5 Jr Sakura (Japan) Vacuum Infiltration Processor
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89640 The dye for TB staining
Von Frey filament UGO Basile (Italy)  37450-275 Equipment for MWT assay
Wire mesh platform  Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. Equipment for MWT assay

References

  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhang, H., Bao, R., Xu, J., Ge, Y., Chen, Z., Fan, M., Yu, G., Zhou, L., Guo, L., Shan, L., Bao, H. Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (195), e64475, doi:10.3791/64475 (2023).

View Video