Tam Kat Kıkırdak Defektlerinin Sıçan Modelinin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak ve sonraki ağrı davranışını ve histopatolojik değişiklikleri ölçerek tam kat kıkırdak defektleri (FTCD) modeli oluşturur.
Abstract
Travma sonucu diz ekleminin kıkırdak defektleri klinikte sık görülen bir spor eklemi yaralanmasıdır ve bu defektler eklem ağrısı, hareket bozukluğu ve sonunda diz osteoartriti (kOA) ile sonuçlanır. Bununla birlikte, kıkırdak kusurları ve hatta kOA için çok az etkili tedavi vardır. Terapötik ilaçlar geliştirmek için hayvan modelleri önemlidir, ancak kıkırdak kusurları için mevcut modeller tatmin edici değildir. Bu çalışma, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak tam kalınlıkta bir kıkırdak defekti (FTCD) modeli oluşturdu ve sonraki ağrı davranışı ve histopatolojik değişiklikler okuma deneyleri olarak kullanıldı. Ameliyattan sonra, insan kıkırdak defektlerinde gözlenen patolojik değişikliklerle tutarlı olarak mekanik geri çekilme eşiği azaldı, yaralı bölgedeki kondrositler kayboldu, matriks metalloproteinaz MMP13 ekspresyonu arttı ve tip II kollajen ekspresyonu azaldı. Bu metodolojinin uygulanması kolay ve basittir ve yaralanmadan hemen sonra büyük gözlem sağlar. Ayrıca, bu model klinik kıkırdak kusurlarını başarılı bir şekilde taklit edebilir, böylece kıkırdak defektlerinin patolojik sürecini incelemek ve karşılık gelen terapötik ilaçları geliştirmek için bir platform sağlar.
Introduction
Eklem kıkırdağı, kondrositler ve hücre dışı matriks1’den oluşan oldukça farklılaşmış ve yoğun bir dokudur. Eklem kıkırdağının yüzey tabakası, pürüzsüz bir yüzeye, düşük sürtünmeye, iyi mukavemete ve elastikiyete ve mükemmel mekanik stres toleransına sahip bir hiyalin kıkırdak şeklidir2. Hücre dışı matris, kollajen proteoglikan ve sudan oluşur ve tip II kollajen, toplam kollajenin yaklaşık %90’ını oluşturduğu için kollajenin ana yapısal bileşenidir3. Kıkırdak dokusunda kan damarı veya sinir bulunmadığından, yaralanmadan sonra kendi kendini onarma yeteneğinden yoksundur4. Bu nedenle travma sonucu oluşan kıkırdak defektleri kliniklerde her zaman inatçı bir eklem hastalığı olmuştur; Ek olarak, bu eklem hastalığı gençleri vurma eğilimindedir ve küresel insidans artmaktadır 5,6. Diz eklemi, kıkırdak defektlerinin en yaygın bölgesidir ve buradaki kusurlara eklem ağrısı, eklem disfonksiyonu ve eklem kıkırdak dejenerasyonu eşlik eder ve sonunda diz osteoartritine (kOA) yol açar7. Diz ekleminin kıkırdak defektleri hastalara ekonomik ve fizyolojik yükler getirmekte ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkilemektedir8. Bu hastalık, yakın bir çözümü olmayan büyük ve acil bir klinik sorun teşkil etmektedir. Şu anda, cerrahi kıkırdak defektleri için tedavinin temel dayanağıdır, ancak uzun vadeli sonuçları tatmin edici değildir9.
Klinik kıkırdak defektleri sonunda kOA’ya yol açar ve bu nedenle kOA hayvan modelleri, kıkırdak defektlerinin patolojik incelemesi ve ilaç geliştirme için yaygın olarak kullanılır. Hayvan modellerinin oluşturulması, kıkırdak rejenerasyonunu ve fibrokartilaj ile hiyalin kıkırdak arasındaki değişimi gözlemlemek için kullanılabilecek kıkırdak defekti onarımının patofizyolojik sürecini anlamak için önemlidir10. Bununla birlikte, ön çapraz bağ transeksiyonu (ACLT), medial menisküsün destabilizasyonu (DMM), ovariektomi (OVX) ve Hulth’un cerrahi modelleri gibi yaygın olarak kullanılan kOA hayvan modelleri genellikle uzun vadeli modellemeye ihtiyaç duyar ve yalnızca patolojik ve ağrı değerlendirmelerine izin verir, bu da ilaç geliştirmenin etkinliğine sınırlamalar getirir11. Cerrahi modellerin yanı sıra monoiyodoasetat (MIA) ve papain enjeksiyonu gibi kimyasal modeller de kıkırdak defektlerine neden olur, ancak defektin derecesi iyi yönetilemez ve koşullar klinik gerçeklikten uzaktır11. Çarpışma, daha büyük hayvanlarda kıkırdak defektlerini modellemek için başka bir yaklaşımdır, ancak bu yöntem belirli aletlerin kullanımına bağlıdır ve nadiren uygulanır12.
Özetle, mevcut kOA modelleri kıkırdak defektlerinin patogenezini araştırmak veya yeni ilaçlar geliştirmek için ideal değildir ve kıkırdak defektleri için spesifik ve standardize bir modele ihtiyaç vardır. Bu çalışma, sıçanlarda femoral troklear olukta delikler açarak tam kat kıkırdak defektleri (FTCD) modeli oluşturmuştur. Model değerlendirmesi için kaba gözlem, ağrı davranış testleri ve histopatolojik analiz yapıldı. Diğer hayvan kOA modellerinden farklı olarak, bu modelin sıçanların genel durumu üzerinde çok az etkisi vardır. Bu modelleme yaklaşımı erişilebilirdir, iyi yönetilebilir ve kıkırdak defektlerinden kOA’ya ilerlemenin anlaşılmasını ve etkili terapötiklerin geliştirilmesini destekler. Bu model aynı zamanda osteoartritik eklemlerdeki kusurları iyileştirerek kOA’yı önleyen tedavileri test etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, sıçanların femoral troklear oluğunda delikler açarak klinik kıkırdak defektlerini taklit etmek için bir hayvan modelini açıklamaktadır (Ek Şekil 1). Kıkırdak yaralanmasından sonra, periferik nosiseptörlerin uyarılabilirliği veya duyarlılığı artar, bu da ağrı eşiğinde bir azalmaya ve stimülasyona yanıtın artmasına neden olabilir18. Klinik öncesi çalışmalarda, farklı hayvan türlerinde kıkırdak defektlerinin modell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası LQ20H270009), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 82074464 ve 82104890), Zhejiang Geleneksel Çin Tıp Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 2020ZA039, 2020ZA096 ve 2022ZB137) ve Zhejiang İl Sağlık Komisyonu Tıbbi Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Projesi (hibe numarası 2016KYA196) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
