Utvikling og evaluering av en rottemodell av bruskdefekter i full tykkelse
Summary
Denne protokollen etablerer en bruskdefektmodell med full tykkelse (FTCD) ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter og måle påfølgende smerteatferd og histopatologiske endringer.
Abstract
Bruskdefekter i kneleddet forårsaket av traumer er en vanlig sportsleddskade i klinikken, og disse feilene resulterer i leddsmerter, nedsatt bevegelse og til slutt kneartrose (kOA). Imidlertid er det lite effektiv behandling for bruskdefekter eller til og med kOA. Dyremodeller er viktige for å utvikle terapeutiske legemidler, men de eksisterende modellene for bruskdefekter er utilfredsstillende. Dette arbeidet etablerte en bruskdefektmodell (FTCD) med full tykkelse ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter, og den påfølgende smerteoppførselen og histopatologiske endringene ble brukt som avlesningseksperimenter. Etter operasjonen ble den mekaniske tilbaketrekningsterskelen redusert, kondrocytter på det skadede stedet gikk tapt, matriks metalloproteinase MMP13-ekspresjon ble økt, og type II kollagenuttrykk redusert, i samsvar med de patologiske endringene observert i humane bruskdefekter. Denne metodikken er enkel og enkel å utføre og muliggjør grov observasjon umiddelbart etter skaden. Videre kan denne modellen med hell etterligne kliniske bruskdefekter, og dermed gi en plattform for å studere den patologiske prosessen med bruskdefekter og utvikle tilsvarende terapeutiske legemidler.
Introduction
Leddbrusk er et svært differensiert og tett vev bestående av kondrocytter og ekstracellulær matrise1. Overflatelaget av leddbrusk er en form for hyalinbrusk, som har en jevn overflate, lav friksjon, god styrke og elastisitet, og utmerket mekanisk stresstoleranse2. Den ekstracellulære matrisen består av kollagenproteoglykan og vann, og type II kollagen er den viktigste strukturelle komponenten i kollagenet, da det står for ca. 90% av det totale kollagenet3. Siden det ikke finnes blodårer eller nerver i bruskvev, mangler det evnen til selvreparasjon etter skade4. Derfor har bruskdefekter forårsaket av traumer alltid vært en ugjennomtrengelig leddsykdom i klinikker; I tillegg har denne felles sykdommen en tendens til å ramme unge mennesker, og den globale forekomsten øker 5,6. Kneleddet er det vanligste stedet for bruskdefekter, og defekter her ledsages av leddsmerter, ledddysfunksjon og leddbruskdegenerasjon, som til slutt fører til kneartrose (kOA)7. Bruskdefekter i kneleddet medfører økonomiske og fysiologiske belastninger for pasientene og påvirker pasientens livskvalitetalvorlig 8. Denne sykdommen utgjør en stor og akutt klinisk utfordring uten forestående løsninger. For tiden er kirurgi bærebjelken i behandlingen for bruskdefekter, men det langsiktige resultatet er fortsatt utilfredsstillende9.
Kliniske bruskdefekter fører til slutt til kOA, og derfor brukes kOA dyremodeller ofte til patologisk studie av bruskdefekter og medikamentutvikling. Etablering av dyremodeller er viktig for å forstå den patofysiologiske prosessen med reparasjon av bruskdefekter, som kan brukes til å observere bruskregenerering og endringen mellom fibrobrusk og hyalinbrusk10. Imidlertid trenger ofte brukte kOA-dyremodeller, som kirurgiske modeller av fremre korsbåndtranseksjon (ACLT), destabilisering av mediale menisker (DMM), ovariektomi (OVX) og Hulth, vanligvis langsiktig modellering og tillater bare patologiske og smerteevalueringer, noe som gir begrensninger for effektiviteten av legemiddelutvikling11. Foruten de kirurgiske modellene resulterer også kjemiske modeller, som monoiodoacetat (MIA) og papaininjeksjon, i bruskdefekter, men graden av defekten kan ikke håndteres godt, og forholdene er langt fra den kliniske virkeligheten11. Kollisjon er en annen tilnærming til å modellere bruskdefekter hos større dyr, men denne metoden avhenger av bruk av spesifikke instrumenter og brukes sjelden12.
Oppsummert er de eksisterende kOA-modellene ikke ideelle for å studere patogenesen til bruskdefekter eller utvikle nye legemidler, og det er behov for en spesifikk og standardisert modell for bruskdefekter. Denne studien etablerte en bruskdefektmodell med full tykkelse (FTCD) ved å bore hull i lårtrochleasporet hos rotter. Grov observasjon, smerteatferdstester og histopatologisk analyse ble utført for modellevaluering. I motsetning til andre dyremodeller av kOA, har denne modellen liten effekt på rottenes allmenntilstand. Denne modelleringstilnærmingen er tilgjengelig, kan håndteres godt og støtter forståelsen av progresjon fra bruskdefekter til kOA og utvikling av effektive terapier. Denne modellen kan også brukes til å teste behandlinger som forhindrer kOA ved å helbrede defekter i pre-osteoartrittiske ledd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien beskriver en dyremodell for etterligning av kliniske bruskdefekter ved å bore hull i lårbenets trochleaspor hos rotter (tilleggsfigur 1). Etter bruskskade forbedres eksitabiliteten eller responsen til perifere nociceptorer, noe som kan resultere i en reduksjon i smerteterskelen og forbedring av respons på stimulering18. I prekliniske studier har modellering av bruskdefekter i forskjellige dyrearter alltid forårsaket smerte19</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Zhejiang Natural Science Foundation (tilskuddsnummer LQ20H270009), Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82074464 og 82104890), Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (tilskuddsnummer 2020ZA039, 2020ZA096 og 2022ZB137) og Medical Health Science and Technology Project of Zhejiang Provincial Health Commission (tilskuddsnummer 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
