Sviluppo e valutazione di un modello di ratto di difetti della cartilagine a tutto spessore
Summary
Questo protocollo stabilisce un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti e misurando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici.
Abstract
I difetti della cartilagine dell’articolazione del ginocchio causati da traumi sono una lesione articolare sportiva comune nella clinica e questi difetti provocano dolori articolari, movimenti alterati e, infine, artrosi del ginocchio (kOA). Tuttavia, c’è poco trattamento efficace per i difetti della cartilagine o addirittura kOA. I modelli animali sono importanti per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli esistenti per i difetti della cartilagine sono insoddisfacenti. Questo lavoro ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti, e il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici sono stati utilizzati come esperimenti di lettura. Dopo l’intervento chirurgico, la soglia di ritiro meccanico è diminuita, i condrociti nel sito danneggiato sono stati persi, l’espressione della metalloproteinasi MMP13 della matrice è aumentata e l’espressione del collagene di tipo II è diminuita, coerentemente con i cambiamenti patologici osservati nei difetti della cartilagine umana. Questa metodologia è facile e semplice da eseguire e consente un’osservazione grossolana immediatamente dopo l’infortunio. Inoltre, questo modello può imitare con successo i difetti clinici della cartilagine, fornendo così una piattaforma per lo studio del processo patologico dei difetti della cartilagine e lo sviluppo di farmaci terapeutici corrispondenti.
Introduction
La cartilagine articolare è un tessuto altamente differenziato e denso costituito da condrociti e matrice extracellulare1. Lo strato superficiale della cartilagine articolare è una forma di cartilagine ialina, che ha una superficie liscia, basso attrito, buona resistenza ed elasticità ed eccellente tolleranza alle sollecitazioni meccaniche2. La matrice extracellulare comprende collagene proteoglicano e acqua, e il collagene di tipo II è il principale componente strutturale del collagene, in quanto rappresenta circa il 90% del collagene totale3. Poiché non esistono vasi sanguigni o nervi nel tessuto cartilagineo, manca la capacità di auto-ripararsi dopo l’infortunio4. Pertanto, i difetti della cartilagine causati da traumi sono sempre stati una malattia articolare intrattabile nelle cliniche; Inoltre, questa malattia articolare tende a colpire i giovani e l’incidenza globale è in aumento 5,6. L’articolazione del ginocchio è il sito più comune di difetti della cartilagine, e i difetti qui sono accompagnati da dolori articolari, disfunzione articolare e degenerazione della cartilagine articolare, che alla fine porta all’artrosi del ginocchio (kOA)7. I difetti della cartilagine dell’articolazione del ginocchio comportano oneri economici e fisiologici per i pazienti e influenzano seriamente la qualità della vita dei pazienti8. Questa malattia rappresenta una sfida clinica importante e urgente senza soluzioni imminenti. Attualmente, la chirurgia è il cardine del trattamento per i difetti della cartilagine, ma il suo esito a lungo termine rimane insoddisfacente9.
I difetti clinici della cartilagine alla fine portano al kOA e, quindi, i modelli animali di kOA sono comunemente usati per lo studio patologico dei difetti della cartilagine e dello sviluppo di farmaci. La creazione di modelli animali è importante per comprendere il processo fisiopatologico di riparazione dei difetti cartilaginei che possono essere utilizzati per osservare la rigenerazione della cartilagine e l’alterazione tra fibrocartilagine e cartilagine ialina10. Tuttavia, i modelli animali kOA comunemente usati, come i modelli chirurgici di transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), destabilizzazione del menisco mediale (DMM), ovariectomia (OVX) e Hulth, di solito richiedono una modellazione a lungo termine e consentono solo valutazioni patologiche e del dolore, il che pone limiti all’efficienza dello sviluppo del farmaco11. Oltre ai modelli chirurgici, anche i modelli chimici, come il monoiodoacetato (MIA) e l’iniezione di papaina, provocano difetti della cartilagine, ma il grado del difetto non può essere ben gestito e le condizioni sono lontane dalla realtà clinica11. La collisione è un altro approccio ai difetti della cartilagine modello negli animali più grandi, ma questo metodo dipende dall’uso di strumenti specifici e viene applicato raramente12.
In sintesi, i modelli di kOA esistenti non sono ideali per studiare la patogenesi dei difetti della cartilagine o sviluppare nuovi farmaci ed è necessario un modello specifico e standardizzato per i difetti della cartilagine. Questo studio ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale nei ratti. Sono stati condotti l’osservazione grossolana, i test sul comportamento del dolore e l’analisi istopatologica per la valutazione del modello. A differenza di altri modelli animali di kOA, questo modello ha scarso effetto sulle condizioni generali dei ratti. Questo approccio modellistico è accessibile, può essere ben gestito e supporta la comprensione della progressione dai difetti della cartilagine al kOA e lo sviluppo di terapie efficaci. Questo modello può anche essere utilizzato per testare terapie che prevengono il kOA curando i difetti nelle articolazioni pre-osteoartritiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio descrive un modello animale per imitare i difetti clinici della cartilagine praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti (Figura supplementare 1). Dopo la lesione della cartilagine, l’eccitabilità o la reattività dei nocicettori periferici è migliorata, il che può comportare una diminuzione della soglia del dolore e il miglioramento della reattività alla stimolazione18. Negli studi preclinici, la modellazione dei difetti della cartilag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla Zhejiang Natural Science Foundation (numero di sovvenzione LQ20H270009), dalla Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82074464 e 82104890), dalla Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (numero di sovvenzione 2020ZA039, 2020ZA096 e 2022ZB137) e dal Medical Health Science and Technology Project della Commissione sanitaria provinciale di Zhejiang (numero di sovvenzione 2016KYA196).
Materials
| 3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
| Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
| Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
| Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
| Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
| Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
| Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
| MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
| Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
| Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
| Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
| Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
| phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
| Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
| Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
| Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
| Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
| Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
| Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
| Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
References
- Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
- Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
- Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
- Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
- Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065 (2022).
- Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
- Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
- Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245 (2022).
- Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
- Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
- Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288 (2018).
- Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
- Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
- Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
- Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639 (2020).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
- Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
- Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
- Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37 (2021).
- Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
- Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
- Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422 (2020).
- Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).
