Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Digitale genkretser basert på CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner

Published: October 18, 2022 doi: 10.3791/64539
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University
* These authors contributed equally

Summary

CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner ble integrert i skjemaet til boolske porter i Saccharomyces cerevisiae. De nye små logiske kretsene viste god ytelse og utdypet forståelsen av både dCas9/dCas12a-baserte transkripsjonsfaktorer og egenskapene til anti-CRISPR-proteiner.

Abstract

Syntetisk gen Boolske porter og digitale kretser har et bredt spekter av applikasjoner, fra medisinsk diagnostikk til miljøvern. Oppdagelsen av CRISPR-Cas-systemene og deres naturlige hemmere - anti-CRISPR-proteinene (Acrs) - gir et nytt verktøy for å designe og implementere in vivo gen digitale kretser. Her beskriver vi en protokoll som følger ideen om "Design-Build-Test-Learn" biologisk ingeniørsyklus og bruker dCas9 / dCas12a sammen med deres tilsvarende Acrs for å etablere små transkripsjonsnettverk, hvorav noen oppfører seg som boolske porter, i Saccharomyces cerevisiae. Disse resultatene peker på egenskapene til dCas9/dCas12a som transkripsjonsfaktorer. Spesielt for å oppnå maksimal aktivering av genuttrykk, må dSpCas9 samhandle med et konstruert stillas-RNA som samler flere kopier av VP64-aktiveringsdomenet (AD). I motsetning til dette skal dCas12a smeltes, på C-terminalen, med den sterke VP64-p65-Rta (VPR) AD. Videre forsterkes ikke aktiviteten til begge Cas-proteinene ved å øke mengden sgRNA / crRNA i cellen. Denne artikkelen forklarer også hvordan du bygger boolske porter basert på CRISPR-dCas-ACR-interaksjonen. Det AcrIIA4-smeltede hormonbindende domenet til den humane østrogenreseptoren er kjernen i en NOT-port som reagerer på β-østradiol, mens AcrVAs syntetisert av den induserbare GAL1-promotoren tillater å etterligne både YES- og NOT-porter med galaktose som inngang. I sistnevnte kretser viste AcrVA5, sammen med dLbCas12a, den beste logiske oppførselen.

Introduction

I 2011 foreslo forskere en beregningsmetode og utviklet et tilsvarende stykke programvare for automatisk utforming av digitale syntetiske genkretser1. En bruker måtte spesifisere antall innganger (tre eller fire) og fylle ut kretsens sannhetstabell; Dette ga all nødvendig informasjon for å utlede kretsstrukturen ved hjelp av teknikker fra elektronikk. Sannhetstabellen ble oversatt til to boolske formler via Karnaugh-kartmetoden2. Hver boolske formel er laget av klausuler som beskriver logiske operasjoner (sum eller multiplikasjon) blant (en del av) kretsinngangene og deres negasjoner (bokstavene). Klausuler blir i sin tur enten summert (OR) eller multiplisert (OG) for å beregne kretsutgangen. Hver krets kan realiseres i henhold til hvilken som helst av de to tilsvarende formlene: en skrevet i POS (produkt av summer) form og den andre i SOP (summen av produkter) representasjon. Den førstnevnte består av en multiplikasjon av setninger (dvs. boolske porter) som inneholder en logisk sum av bokstavene. Sistnevnte er derimot en sum av klausuler der bokstavene multipliseres.

Elektriske kretser kan realiseres, på et brødbrett, ved fysisk å koble forskjellige porter sammen. Den elektriske strømmen tillater utveksling av signaler mellom porter, noe som fører til beregning av utgangen.

I biologien er situasjonen mer kompleks. En boolsk port kan realiseres som en transkripsjonsenhet (TU; dvs. sekvensen "promoter-coding region-terminator" inne i eukaryote celler), hvor transkripsjon eller oversettelse (eller begge deler) er regulert. Dermed etablerer minst to typer molekyler en biologisk ledning: transkripsjonsfaktorproteinene og de ikke-kodende, antisense-RNAene1.

En gen digital krets er organisert i to eller tre lag med porter, nemlig: 1) inngangslaget, som er laget av JA (buffer) og IKKE porter og konverterer inngangskjemikaliene til ledningsmolekyler; 2) det indre laget, som består av like mange TUer som det er klausuler i den tilsvarende boolske formelen. Hvis kretsen er utformet i henhold til SOP-formelen, vil hver klausul i det indre laget produsere kretsutgangen (f.eks. fluorescens) i en såkalt distribuert utgangsarkitektur. Hvis formelen for sum (POS) brukes, kreves et 3) endelig lag, som vil inneholde en enkelt multiplikativ port som samler ledningsmolekylene fra det indre laget.

Samlet sett, i syntetisk biologi, kan mange forskjellige ordninger utformes for samme krets. De varierer i antall og type både TU og ledningsmolekyler. For å velge den enkleste løsningen som skal implementeres i gjærceller, er hver kretsdesign knyttet til en kompleksitetsscore S, definert som

Equation 1

hvor A representerer antall aktivatorer, R representerer antall repressorer, og a er mengden antisense RNA-molekyler. Hvis enten aktivatorer eller repressorer er fraværende fra kretsen, er deres bidrag til S null. Derfor er det vanskeligere å realisere et kretsskjema i laboratoriet (høy S) når det krever et høyt antall ortogonale transkripsjonsfaktorer. Dette betyr at nye aktivatorer og repressorer skal konstrueres for å realisere hele ledningene inne i de digitale kretsene. I prinsippet kan nye DNA-bindende proteiner settes sammen ved å bruke Zinc Finger proteiner3 og TAL effektorer4 som maler. Dette alternativet virker imidlertid for vanskelig og tidkrevende; Derfor bør man stole mest på små RNA og oversettelsesregulering for å fullføre komplekse genkretser.

Opprinnelig ble denne metoden utviklet for å fremstille digitale kretser i bakterier. Faktisk, i eukaryote celler, i stedet for antisense-RNAer, er det mer egnet til å snakke om mikroRNA (miRNA) eller små forstyrrende RNA (siRNAer)5. Imidlertid er RNAi-banen ikke tilstede i gjæren S. cerevisiae. Derfor bør man velge fullt transkripsjonsnettverk. Anta at en krets trenger fem aktivatorer og fem repressorer; dens kompleksitetspoeng vil være S = 32. Kretskompleksiteten kan reduseres ved å erstatte de 10 transkripsjonsfaktorene med en enkelt dCas96 (nukleasemangelfull Cas9) smeltet til et aktiveringsdomene (AD). Som vist i7, fungerer dCas9-AD som en repressor i gjær når du binder en promotor mellom TATA-boksen og TSS (transkripsjonsstartstedet) og som en aktivator når den binder godt oppstrøms for TATA-boksen. Dermed kan man erstatte 10 transkripsjonsfaktorer med et enkelt dCas9-AD-fusjonsprotein og 10 sgRNA (single guide RNAs) for en total kompleksitetsscore på S = 11. Det er raskt og enkelt å syntetisere ti sgRNAer, mens, som tidligere kommentert, vil samlingen av 10 proteiner kreve mye lengre og mer komplisert arbeid.

Alternativt kan man bruke to ortogonale dCas-proteiner (f.eks. dCas9 og dCas12a): en for å smelte sammen til en AD, og den andre naken eller i kombinasjon med et undertrykkelsesdomene. Kompleksitetsskåren vil øke med bare én enhet (S = 12). Derfor er CRISPR-dCas-systemer nøkkelen til konstruksjonen av svært intrikate gendigitale kretser i S. cerevisiae.

Dette papiret karakteriserer dypt effektiviteten til både dCas9- og dCas12a-baserte repressorer og aktivatorer i gjær. Resultatene viser at de ikke krever en høy mengde sgRNA for å optimalisere aktiviteten, så episomale plasmider unngås fortrinnsvis. Videre er dCas9-baserte aktivatorer langt mer effektive når de bruker et stillas RNA (scRNA) som rekrutterer kopier av VP64 AD. I motsetning til dette fungerer dCas12a godt når den smeltes direkte til den sterke VPR AD. Videre krever en syntetisk aktivert promotor et variabelt antall målsteder, avhengig av konfigurasjonen av aktivatoren (f.eks. tre ved bruk av dCas12a-VPR, seks for dCas9-VP64, og bare en med dCas9 og et scRNA). Som en repressor virker dCas12a mer skarp når den binder kodeområdet i stedet for promotoren.

Som en ulempe interagerer imidlertid ikke CRISPR-dCas9 / dCas12a direkte med kjemikalier. Derfor kan de være til ingen nytte i inndatalaget. Av denne grunn har alternative boolske portdesign som inneholder anti-CRISPR-proteiner (Acrs) blitt undersøkt. ACR virker på (d) Cas-proteiner og hemmer deres arbeid8. Derfor er de et middel til å modulere aktiviteten til CRISPR-(d) Cas-systemer. Denne artikkelen analyserer grundig interaksjonene mellom type II Acrs og (d) Cas9, samt type V Acrs og (d) Cas12a i S. cerevisiae. Siden Acrs er mye mindre enn Cas-proteiner, ble en NOT-port som reagerer på østrogen β-østradiol bygget ved å fusjonere det hormonbindende domenet til den humane østrogenreseptoren 9-HBD (hER) - til AcrIIA4. Dessuten ble en håndfull YES- og NOT-porter som uttrykte dCas12a(-AD) konstitutivt og AcrVA ved induksjon med galaktose realisert. For tiden tjener disse portene bare som et bevis på konsept. Imidlertid representerer de også det første skrittet mot en dyp nytenkning av algoritmen for å utføre den beregningsmessige automatiske utformingen av syntetiske gen-digitale kretser i gjærceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og konstruksjon av sgRNA / crRNA uttrykkskassett

MERK: Det finnes to typer sgRNA / crRNA-ekspresjonskasetter: en-kalt SNR5210-er sammensatt av RNA-polymerase III-avhengig SNR52-promotor, sgRNA / crRNA-sekvensen og SUP4-terminatoren; en annen forkortet RGR 11 består av RNA-polymerase II-avhengig ADH1-promotor, RGR-strukturen (ribozyme-guide RNA-ribozyme) som inneholder to ribozymer (et hammerhode ribozyme-HH og et hepatitt delta-virus ribozyme-HDV) og sekvensen av sgRNA / crRNA i mellom, og ADH1-terminatoren. De sgRNA-styrende Cas9-homologene er laget av en avstandssekvens og den karakteristiske direkte repetisjonen12, mens crRNA for Cas12a-proteiner består av direkte repetisjon etterfulgt av avstandssekvensen13,14 (se tilleggstabell 1 for alle DNA-sekvenser brukt i denne studien).

  1. Design avstandssekvensen for Cas9/Cas12a-mediert transkripsjonsaktivering.
    1. Utnytt den bakterielle lex-operatorsekvensen (kalt lexOp) til å være målstedet 15,16 og sett den inn i CYC1-promotoren som driver uttrykket av det gjærforsterkede grønne fluorescerende proteinet (yEGFP)17. Derfor er avstandssekvensen definert av og komplementær til den innsatte leksOp.
  2. Kontroller ortogonaliteten til avstandssekvensen via CRISPRDIRECT-verktøyet18.
    1. Lim inn lexOp-sekvensen flankert av PAM-sekvensen i tekstfeltet, definer PAM-sekvensen som NRG for dCas9 og TTTV for dCas12a, og spesifiser arten fra rullegardinlisten som Spirende gjær (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genom. Klikk på Design. Forsikre deg om at det ikke er noe samsvarende målnettsted i 20mer + PAM eller i 12mer + PAM-søk.
  3. Konstruer sgRNA / crRNA-uttrykkskassetten.
    1. Bruk touchdown PCR for å amplifisere DNA-sekvensene til standard biologiske deler, som promotorer, kodingssekvenser og terminatorer.
      1. Forbered en reaksjonsblanding som inneholder: 20-40 ng DNA-mal, 1 μL 10 μM fremoverprimer (dvs. ot25, sgRNA / crRNA ekspresjonsplasmidkonstruksjon), 1 μL 10 μM omvendt primer (dvs. ot26, sgRNA / crRNA ekspresjonsplasmidkonstruksjon), 5 μL 2,5 mM dNTP-blanding, 0,5 μL DNA-polymerase, 10 μL 5x DNA-polymerasereaksjonsbuffer, og dobbeltdestillert vann (ddH2O) opp til et totalt volum på 50 μL.
        MERK: Se tilleggstabell 2 for en liste over primere som ble brukt i denne studien.
      2. Kjør touchdown PCR-programmet på en termosyklist:
        Stadium 1: 98 °C i 30 s.
        Fase 2 med 10 sykluser: 98 °C i 10 s, 68 °C i 20 s og 72 °C i 15 s.
        Fase 3 med 25 sykluser: 98 °C i 10 s, 59 °C i 20 s og 72 °C i 15 s.
        Etappe 4: 72 °C i 2 min.
        Hold til slutt på 4 °C før du starter oppfølgingseksperimentene.
        MERK: 68 °C i trinn 2 og 59 °C i trinn 3 avhenger av smeltetemperaturen til både forover- og reversprimere, som varierer fra forskjellige primerpar. Tiden ved 72 °C i trinn 2 og 3 bestemmes av PCR-produktets lengde og DNA-polymerasens hastighet.
    2. Isoler PCR-produktene via gelelektroforese (100 V, 30 min). Elute DNA-sekvensene fra agarosegelen via et DNA-gelekstraksjonssett (se materialtabell).
      MERK: En 0,8% agarosegel er nødvendig for fragmenter lengre enn 500 nt, en 1,5% agarosegel for fragmenter mellom 100 nt og 500 nt, og en 2% agarosegel for fragmenter kortere enn 100 nt.
    3. Sett inn TU som uttrykker sgRNA / crRNA i en pRSII404/424 skyttelvektor19, som inneholder ampicillinresistensgenet og det gjærvalgbare auxotrofiske markørgenet TRP1.
      1. Fordøy skyttelvektoren ved 37 °C i 1 time med de to restriksjonsenzymene SacI og Acc65I. Forbered reaksjonsblandingen ved å tilsette 5 μg av skyttelvektoren, de anbefalte mengdene enzymer, fordøyelsesbuffer (i henhold til enzyminstruksjonene) ogddH2Oopp til et totalt volum på 30 μL.
      2. Kontroller transportvektorens fordøyelse via gelelektroforese (se undertrinn 1.3.2). Inaktiver deretter de to enzymene ved 65 °C i 20 minutter.
      3. Bruk Gibson-monteringsmetode 20 for å sette de rensede PCR-produktene inn i den åpne skyttelvektoren ved å slippe inn den ekvimolare DNA-blandingen ved50 °C i 1 time.
      4. Transformer Escherichia coli DH5α kompetente celler med ovennevnte Gibson-reaksjonsblanding via varmesjokktransformasjonsmetoden21. Overfør de transformerte E. coli-cellene til Luria-Bertani (LB) agarplater som inneholder ampicillin (0,1 g / L). Sett platene inn i inkubatoren ved 37 °C og la cellene vokse over natten.
      5. Plukk fire kolonier fra LB-agarplaten og dyrk dem separat over natten ved 37 °C i LB-oppløsning inneholdende ampicillin (0,1 g/L). Bruk deretter mini-preparasjonsprosedyren for å trekke ut plasmider fra E. coli-cellene 22.
      6. Bruk primerne ot18 og ot19 (se tilleggstabell 2 for oligosekvenser) for å sekvensere og bekrefte den innsatte transkripsjonsenheten via Sanger-metoden23.
        MERK: I senere eksperimenter vil de konstruerte og bekreftede plasmidene bli satt inn i gjærgenomet via PEG / LiAc-protokollen24.

2. Design og konstruksjon av stillaset RNA-uttrykkskassett

MERK: Stillasføringen RNA (scRNA) består av sgRNA-sekvensen og MS2-hårnålsstrukturene25. To typer MS2-hårnålsstrukturer brukes i dette arbeidet: villtype MS2 hårnål-wt og f6 MS2 pelsprotein (MCP) aptamer-f6.

  1. Syntetiser en scRNA-mal som er i stand til å imøtekomme forskjellige avstandsstykkersekvenser (dvs. pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
    MERK: I denne studien ble scRNA-malen syntetisert av et gensyntesefirma (se materialfortegnelse).
  2. Design riktige primere (se tilleggstabell 2) for å kjøre PCR på de nødvendige avstandssekvensene.
  3. Følg prosedyrene i trinn 1.3 for å konstruere en scRNA-uttrykkskassett.

3. dSpCas9 engineering og uttrykk plasmidkonstruksjon

  1. Få plasmidet pTPGI_dSpCas9_VP64 (se materialfortegnelse).
  2. Konstruer akseptorvektoren pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, basert på pRSII406-skyttelvektoren, via touchdown PCR og Gibson-monteringsmetoden (se trinn 1.3). Plasmidet gir en sterk konstitutiv promotor-pGPD, og en terminator-CYC1t.
  3. Fordøy det pTPGI_dCas9_VP64 plasmidet og den nykonstruerte akseptorvektoren (5 μg i 1 time eller 10 μg for over natten – se trinn 1.3.3.1 som referanse) med XbaI og XhoI ved 37 °C. Separer og rens innsatsfragmentet og akseptorvektoren som i trinn 1.3.2.
  4. Liger det rensede innsatsfragmentet og akseptorvektoren med T4 DNA-ligase ved 16 °C i 8 timer. Forbered ligeringsløsningen ved å tilsette 50-100 ng av den rensede akseptorvektoren, rensede målfragmenter i ekvimolær mengde med akseptorvektoren, 1,5 μL T4-buffer, 0,5 μL T4-ligase ogddH2Oopp til et totalt volum på 15 μL.
  5. Følg trinn 1.3.3.3 og 1.3.3.4. Bekreft deretter at det nykonstruerte plasmidet er korrekt ved fordøyelse med XbaI og Xhol (37 °C, 1 time) og gelelektroforese (se trinn 1.3.2).

4. dCas12a konstruksjon og plasmidkonstruksjon

  1. Konstruer plasmidene som uttrykker dCas12a-AD.
    1. Syntetiser to gjærkodonoptimaliserte dCas12a-proteiner (denAsCas12a og dLbCas12a) flankert av BamHI og Xhol-restriksjonsenzymsteder.
      MERK: I denne studien ble de to gjærkodonoptimaliserte dCas12a-proteinene syntetisert av et gensyntesefirma (se materialtabell).
    2. Konstruer akseptorvektoren pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via touchdown PCR og Gibson-monteringsmetoden (se trinn 1.3), der "promotoren" er enten pGPD eller pGAL1, "sp" representerer en kort tilfeldig sekvens, og "AD" er enten VPR eller VP64.
    3. Sett inn hvert dCas12a-protein i de to nykonstruerte akseptorvektorene via fordøyelse med BamHI og XhoI og ligering med T4 DNA-ligase (se trinn 3.3 og 3.4).
  2. Konstruer plasmidene som uttrykker en bar dCas12a.
    1. Konstruer en akseptorvektor for de galaktoseinduserbare uttrykkskassetter av dCas12a som pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t ved bruk av touchdown PCR og Gibson-monteringsmetoden (se trinn 1.3).
    2. Fordøy plasmidene som inneholder dCas12a-proteinene og ovennevnte akseptorvektor med BamHI og Xhol, og liger dem deretter med T4 DNA-ligase for å få plasmidet pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t (se trinn 3.3 og 3.4).
    3. Fordøy plasmidet oppnådd i trinn 4.2.2 med Acc65I og BamHI, og erstatt deretter pGAL1 med pGPD via touchdown PCR og Gibson-monteringsmetoden for å konstruere pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t.

5. Anti-CRISPR proteinteknikk og plasmidkonstruksjon

MERK: Tre typer promotorer har blitt brukt til å drive Acrs-uttrykk: en induserbar promotor-pGAL1, fire gjærkonstituerende promotorer-pGPD, pACT1, pTEF1 og pTEF2, og en syntetisk konstitutiv promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA26.

  1. Få plasmidene som inneholder sekvensene av type II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA427 og AcrIIA5 28) og type V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 og AcrVA529) fra et gensyntesefirma.
  2. Konstruer plasmidene basert på pRSII403 skyttelvektoren for å uttrykke Acrs.
    1. Konstruer AcrIIA-uttrykkskasetter.
      MERK: Bruk touchdown PCR til å forsterke fire forskjellige promotorer (dvs. pGPD, pACT1, pTEF2 og genCYC1t_pCYC1noTATA), de tre typene AcrIIA og to terminatorer (ADH1t og CYC1t). Bygg en serie TUer som uttrykker AcrIIAer, under forskjellige promotorer, via Gibson-monteringsmetoden (se trinn 1.3).
    2. Konstruer AcrVA-uttrykkskasetter.
      1. Syntetiser akseptorsekvensen: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, der "sp" er en tilfeldig sekvens som vil bli erstattet av AcrVA senere.
        MERK: I denne studien ble akseptorsekvensene syntetisert av et gensyntesefirma (Table of Materials).
      2. Monter akseptorvektorene pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, der "promotoren" er: pGAL1, pTEF1 og genCYC1t_pCYC1noTATA. Bruk Gibson-monteringsmetoden (se trinn 1.3).
      3. Sett inn hver av de tre AcrVAene i akseptorvektoren beskrevet i trinn 5.2.2.2 (via touchdown PCR og Gibson-monteringsmetoden [se trinn 1.3]) for å bygge et sett med plasmider som produserer AcrVA.
  3. Videre konstruerer AcrIIA4 ved å utvide sekvensen med sekvensene til GS-linkeren og HBD (hER). Dette tillater bygging av en β-østradiol-responsiv krets.
    1. Bruk touchdown PCR for å få GS-HBD og AcrIIA4 deler separat (se trinn 1.3.1).
    2. Sett AcrIIA4, GS-HBD og skyttelvektoren inn i Gibson-blandingen og konstruer hele plasmidet via Gibson-metoden (se trinn 1.3.3).

6. crRNA-deteksjon: RT-qPCR og primers design

MERK: crRNA-deteksjon ble oppnådd via RT-qPCR, som er organisert i tre trinn.

  1. Utfør RNA-ekstraksjon og rensing fra gjærceller via et RNA-sett.
    1. Kultur gjærceller over natten i 2 ml syntetisk definert komplett medium (SDC, 1 L volum: 20 g glukose, 2 g AA-blanding, 6,7 g YNB, 396 mg leucin, 79,2 mg tryptofan, 79,2 mg histidin og 79,2 mg uracil) ved å bruke en 24-brønnplate (240 rpm, 30 ° C).
    2. Om morgenen, fortynn cellekulturen (1:100) til 2 ml fersk SDC og fortsett å vokse gjærcellene ved 30 ° C, 240 rpm, i ytterligere 4 timer.
    3. Høst hele 2 ml av celleoppløsningen og sentrifugen ved 20 238 x g i 2 minutter. Fjern supernatanten forsiktig siden cellepelleten er liten.
    4. Trekk ut RNA fra gjærceller ved hjelp av et RNA-sett.
    5. Sjekk RNA-kvaliteten.
      1. Forbered en 1% agarosegel. Bland 5 μL av hver RNA-prøve med 1 μL DNA-lastefargestoff. Legg deretter blandingen på gelen og kjør den.
      2. Sørg for at to klare bånd ved ~4000 nt og ~2000 nt, tilsvarende ribosomalt RNA (25S/18S), er tilstede på gelen. Et ytterligere uskarpt bånd kan sees på ~ 80 nt for tRNA.
    6. Bruk RNA-prøvene umiddelbart for cDNA-syntese eller lagre dem ved -80 ° C for fremtidig bruk.
  2. Omvendt transkripsjon: Bruk stamsløyfemetoden 30 for å danne den første strengen av cDNA som tilsvarer crRNA (40 nt). For revers transkripsjon av sgRNA (nesten 100 nt) er prosedyren den samme som for cDNA-syntesen av referansegenet ACT1.
    MERK: Metoden for revers transkripsjon av crRNA er forskjellig fra den som brukes med sgRNA og ACT1 mRNA. Siden crRNA er veldig kort, ble det behandlet som et mikroRNA og brukte microRNA revers transkripsjonsmetode (stem-loop tilnærming) for å oppnå tilsvarende cDNA. To cDNA-syntesesett (et stammesløyfesett for crRNA og et vanlig reverstranskripsjonssett for ACT1-genet ) ble brukt i crRNA-kvantifisering. Den samme mengden RNA ble brukt i de to settene (se materialtabell) for å gjøre eksperimentresultatene sammenlignbare. Primeren som ble brukt med stammesløyfesettet ble designet i henhold til stammesløyfesekvensen og de siste seks nukleotidene i 3'-enden av crRNA (for stammesløyfen og primersekvensen, se tilleggstabell 2).
    1. Stem-loop metode for crRNA revers transkripsjon
      1. Ta RNA-malen, primeren og bufferne ut av fryseren og la dem smelte på is.
      2. Genomisk DNA-fjerning: Forbered først 10 μL av reaksjonsblandingen i henhold til settinstruksjonene. Ha blandingen i en termosyklist ved 42 °C i 2 minutter. Til slutt overfører du den til is.
      3. Syntese av den første cDNA-strengen: Forbered 20 μL av reaksjonsblandingen ved å tilsette 10 μL av blandingen fra trinn 6.2.1.2, 1 μL stammesløyfeprimer (2 μM-konsentrasjon), 2 μL 10x RT-reaksjonsbuffer, 2 μL revers transkripsjonsenzymblanding (inneholdende revers transkriptase) og 5 μL RNasefriH2O.
      4. Plasser reaksjonsblandingen i en termisk syklist og kjør følgende program: 25 °C i 5 minutter, 50 °C i 15 minutter og 85 °C i 5 minutter. Bruk produktet til qPCR-reaksjonen umiddelbart eller oppbevar det ved -80 °C.
    2. sgRNA og ACT1 mRNA revers transkripsjon
      1. Første reaksjon: Forbered en 13 μL-blanding bestående av primerblandingen, dNTP-blandingen, RNA-malen (50 pg-5 μg) og RNase-fritt vann (bortsett fra RNA-malen, alt levert av settet), i henhold til settinstruksjonene. Bruk 1 μg RNA-mal. Ha blandingen i en termosyklist ved 70 °C i 10 minutter.
      2. Andre reaksjon (cDNA-syntese): Forbered reaksjonsblandingen ved å tilsette reagensene (som beskrevet i settinstruksjonene) til 13 μL av den første reaksjonsoppløsningen opp til et endelig volum på 20 μL. Plasser blandingen i en termisk syklist i 15 minutter ved 50 °C og deretter i ytterligere 5 minutter ved 85 °C. Bruk produktet til qPCR-reaksjonen umiddelbart eller oppbevar det ved -80 °C.
  3. SYBR-sett for qPCR: Deteksjon av Ct-verdi
    MERK: Den omvendte primeren som brukes i qPCR av crRNA er fast fordi den tilsvarer det omvendte komplementet til stammesløyfesekvensen (se tilleggstabell 2). Den fremre primeren er derimot variabel og avhenger av sekvensen av crRNA. Forover og bakover primere for sgRNA og ACT1 mRNA qPCR er designet på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. To grunninger velges når forskjellen mellom smeltetemperaturen ikke er større enn 2 °C (se tilleggstabell 2). Hver prøve måles i tre replikater.
    1. Forbered qPCR-reaksjonsblandingen i henhold til produsentens instruksjoner for SYBR-settet.
    2. Sett følgende qPCR-program i en PCR-maskin i sanntid.
      Preinkubasjon: 10 min ved 95 °C.
      PCR-stadium: 15 s ved 95 °C, etterfulgt av 34 s ved 55 °C. Sett syklusen til PCR-trinnet til 45 ganger. Smeltetrinn: 10 s ved 95 ° C, etterfulgt av 60 s ved 65 ° C, og til slutt 1 s ved 97 ° C.
    3. Beregn de relative mRNA-uttrykksverdiene via Pfaffl-formelen31.

7. Immunfluorescens for å oppdage Cas-proteiner

MERK: Cas-proteiner (CasP) er fusjonert til en His_tag.

  1. Gjærcelle forberedelse
    1. Plukk noen gjærceller ved hjelp av en steril sløyfe og dyrk dem i 5 ml YPD-rikt medium over natten ved 240 o / min ved 30 ° C. Om morgenen, tilsett 500 μL av celleløsningen til 20 ml fersk YPD og dyrk dem ved 240 rpm ved 30 ° C til OD600 når 0,6.
    2. Ta 5 ml av kulturen og bland den med 500 μL 37% formaldehyd. La blandingen holde seg ved romtemperatur (RT) i 10 minutter. Høst cellene ved sentrifugering ved 1,500 x g i 5 minutter.
    3. Fjern supernatanten og resuspender cellene med 1 ml fikseringsbuffer (0,1 M KH 2 PO4, 0,5 M MgCl2, 3,7% formaldehyd, pH = 6,5). Hold celleoppløsningen ved RT i 20 minutter.
    4. Sentrifuger celleløsningen ved 1 500 x g i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml vaskebuffer (0,1 M KH 2 PO 4,1,2M sorbitol, pH = 6,5) supplert med 4 μL beta-merkaptoetanol og4 mikrol lysatoppløsning (5 mg/ml). Sett celleoppløsningen i en inkubator ved 37 °C i 20 minutter.
    5. Sentrifuger celleoppløsningen ved 1 500 x g i 5 minutter og kast supernatanten. Vask cellepelleten to ganger med 1 ml PBS ved sentrifugering (1 500 x g i 5 minutter).
    6. Resuspender cellene i 100 μL PBS pluss 0,05% Tween 20 og tilsett 4 μL BSA-oppløsning (10 mg / ml). Hold celleoppløsningen ved RT i 20 minutter.
  2. Inkubasjon med primært antistoff
    1. Legg til Anti-His tag primære antistoff til blandingen i trinn 7.1.6 ved en 1:400 fortynning. Hold løsningen på RT i 2 timer.
    2. Sentrifuger blandingen i trinn 7.2.1 ved 1 500 x g i 5 minutter og fjern supernatanten. Tilsett 1 ml PBST og sentrifuge (1 500 x g) i 5 minutter for å vaske cellepelleten. Gjenta denne operasjonen to ganger. Til slutt kaster du supernatanten og suspenderer cellene i 100 μL på 1x PBST.
  3. Mikroskopi celle deteksjon
    1. Monter cellene på et lysbilde; Ta 2 μL av celleløsningen fra trinn 7.2.2 og legg den på et glassglass. Dekk det med en coverslip.
    2. Observer cellene under et fluorescensmikroskop. Slå på fluorescerende lyskilde, mikroskop og datamaskin. Skriv ned det fluorescerende lyskildenummeret og åpne mikroskopprogramvaren på datamaskinen.
    3. Sett lysbildet på mikroskopstadiet. Velg 40x objektivlinsen og observer cellene under det grønne lyset (550 nm). Beveg den grove fokusknappen til konturen av gjærceller vises. Beveg den fine fokusknappen for å fokusere cellene.
    4. Oppdag cellene med mikroskopprogramvaren. Lukk mikroskopfeltet og bytt til dataskjermen. Klikk på Live, vent i 3-5 s, og klikk på Capture for å ta et bilde. Lagre bildet.
    5. Slå av datamaskinen, mikroskopet og fluorescerende lyskilde.

8. Datainnsamling: FACS

MERK: Grønn fluorescens detekteres via flowcytometri (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS] målinger). Gjærceller dyrkes generelt ved 30 ° C og 240 o / min for å kjøre FACS-eksperimenter. Imidlertid kan celler kreve noen forholdsregler avhengig av deres genetiske innhold. Celler som inneholder dCas12a-VPR-genet (kontrollert av GPD-konstitutiv promotor) må dyrkes i 24 timer i SDC-løsningen. Etterpå fortynnes cellene i forholdet 1:100 i fersk SDC og dyrkes i ytterligere 12 timer før fluorescensintensiteten måles. Celler modifisert med AcrIIA4-HBD (hER) genet krever også fortynning. Videre må OD600 kontrolleres. Først får cellene vokse i SDC over natten (over 14 timer). Om morgenen måles OD600. Deretter fortynnes kulturen i SDC, leveres med en variert konsentrasjon av β-østradiol, ned til OD600 = 0,1. Før FACS-eksperimenter dyrkes cellene i ytterligere 7 timer slik at OD600 når 0,8-1,0. Celler som uttrykker dCas9-VP64 eller dCas12a-VP64 dyrkes i SDC i 20-24 timer uten fortynning og videre vekst før målingene på FACS-maskinen.

  1. Slå på FACS-maskinen 20 minutter før målingene for å varme opp laseren.
  2. Forbered prøvene (fortynning): bland 20 μL av cellekulturen med 300 μLddH2O.
  3. Kjør FACS-programvaren på datamaskinen som er koblet til FACS-maskinen, og opprett et nytt eksperiment. Angi måleparametrene (dvs. FSC(SSC)-A/H/W og histogram).
  4. Velg filteret i henhold til eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til prøvene. For eksempel er målproteinet her yEGFP, hvis eksitasjons- og utslippsbølgelengder er henholdsvis 488 nm og 507 nm. Så velg FITC- eller GFP-filteret (eksitasjonsbølgelengde: 488 nm; utslippsbølgelengde: 527/32 nm). Sett anskaffelsescellenummeret til 10 000.
  5. Juster FITC-filterspenningen ved å måle intensiteten til fluorescerende perler. Sørg for at den relative forskjellen i intensiteten til perlene mellom to påfølgende eksperimenter ikke overstiger 5%.
  6. Vask maskinen med ddH2O i noen sekunder for å fjerne eventuelle overflødige perler.
  7. Mål fluorescensintensiteten i prøven. Klikk på Forhåndsvisning og vent i 3-5 s for prøveinjeksjonsstabilitet. Til slutt klikker du på Anskaff.
  8. Mål perlene igjen på slutten av eksperimentet. Spenningen er den som ble brukt under målingen av de første perlene (se trinn 8.4, 438-441 V). Sjekk om den relative forskjellen mellom de to perlenes målinger overstiger 5%.
  9. Eksporter FACS-dataene som FCS-filer.
  10. Analyser FCS-filene med R Studio-programvaren.

9. Analyse av data

MERK: Bruk Flowcore R Bioconductor-pakke 32 i R studio. FCS-filene ble analysert ved hjelp av et skript skrevet i R-språk.

  1. Åpne R studio og last inn skriptet Bdverse analyse. R for å analysere FCS-filene.
  2. Angi eksperimentnavnet (ename), katalogen (banen) der FCS-filene er
    Lagret (dir_d), og hvor resultatfilene skal opprettes (dir_r).
  3. Still inn fluorescenskanalen. For eksempel select_ch = "GPA-A" hvis grønn fluorescens ble målt.
  4. Angi antall prøver som ble målt (s_num).
  5. Angi dimensjonene til hvert punktplott (sxlim, sylim). Angi maksimal lengde på x- og y-aksen for stolpediagrammer og boksplott (xlimit, ylimit). xlimit må være større enn eller lik s_num.
  6. Velg gating-metoden ved å fjerne # fra de tilsvarende linjene.
    MERK: morphGate er en automatisk gating-metode utført av skriptet (dvs. regionen av punktplottene der cellene er tettere, gjenkjennes og velges av programmet). polygonGate og rectangleGate krever å se på punktplottene og definere enten hjørnene til et polygon eller siden av et rektangel som omfavner sonen der de fleste cellene ligger.
  7. Velg flowSet-objektet gated, som tilsvarer den valgte gating-metoden. Velg punktplottoppløsningen (res; skal være minst lik 256).
  8. Uncomment flt_low <- filter_low(sp) for å fjerne målinger der fluorescens er negativ. Uncomment flt_sp <- filter (flt_lw) for å fjerne uteliggere på grunn av andre eksperimenter.
  9. Trykk på Source og kjør skriptet. Alle filene som inneholder resultatene fra analysen, opprettes i dir_r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

sgRNA / crRNA-ekspresjon av en RNA-polymerase III-type promotor
Først adresserte dette arbeidet prosjekteringen av transkripsjonsaktiveringskretsen (krets 1) vist i figur 1A. Den inneholdt tre grunnleggende komponenter: 1) genet som koder for yEGFP (reporteren), som ble innledet av en serie forskjellige syntetiske promotorer som ga målsteder for dCas9 / dCas12a-AD; 2) en gjærkodonoptimalisert versjon av dCas9 eller dCas12a smeltet sammen til et aktiveringsdomene (henholdsvis VP64 og VPR) og inneholder enten en eller to kjernefysiske lokaliseringssekvenser (NLS). Begge dCas-proteinene ble produsert av en sterk konstitutiv promotor-pGPD; og 3) en sgRNA / crRNA-sekvens som ledet dCas9 / dCas12a-AD til målstedene. Aktiveringseffektiviteten til dCas9/dCas12a-baserte aktivatorer ble visualisert og reflektert av fluorescensintensiteten til reporteren (målt via FACS-eksperimenter).

Ett dCas9-protein (dSpCas9) og to dCas12a-proteiner (denAsCas12a og dLbCas12a) ble testet. En 3,36 ganger aktivering ble oppnådd med dSpCas9 utvidet, ved C-terminalen, med VP64 AD og binding av en syntetisk promotor-oppstrøms for yEGFP-inneholdende seks kopier av lexOp-målstedet. SgRNA ble plassert i en integrerende skyttelvektor og transkribert av RNA-polymerase III-avhengig SNR52-promotor ( SNR52i-konfigurasjon , se figur 1B). Når det gjelder dCas12a, returnerte denAsCas12a-VPR den høyeste aktiveringen (4,45 ganger) fra en syntetisk promotor med tre operatorer når crRNA ble uttrykt via SNR52i-konfigurasjonen (figur 1C). Under de samme forholdene oppnådde dLbCas12a-VPR sin beste fluorescensforbedring (3,21 ganger) (figur 1D). Det skal bemerkes at sammenligningsbegrepet i hvert eksperiment var en krets hvis sgRNA / crRNA ikke kunne binde lex-operatørene.

Multikopiplasmider er ikke nødvendig
SNR52i sgRNA-ekspresjonskassett ble erstattet med en RGR-struktur uttrykt av en moderat sterk promotor-pADH1. I både dCas9- og dCas12a-tilfeller syntes imidlertid aktivering i nærvær av et sgRNA / crRNA generert av selvspaltningen av RGR sammenlignbart med eller enda lavere enn det som ble oppnådd med et sgRNA / crRNA produsert via SNR52i, til tross for at pSNR52 ble ansett som en svak promotor (se figur 1C, D for de første resultatene oppnådd med dCas12a).

For ytterligere å utforske sammenhengen mellom sgRNA / crRNA-mengde og aktiveringseffektivitet ble de to sgRNA / crRNA-ekspresjonssystemene satt inn i et episomalt plasmid, som kan tas opp av cellen i 10-40 kopier og generere en større mengde sgRNA / crRNA. Som vist i figur 2A var aktiveringen av crRNA lokalisert på et integrativt plasmid (enten SNR52i eller RGRi) 1,4 til 2,4 ganger høyere enn det som ble oppnådd når det samme crRNA ble uttrykt av et episomalt plasmid (enten SNR52m eller RGRm). Trenden ble bekreftet av sgRNA. I dette tilfellet garanterte det integrerende plasmidet en 1,1 til 1,5 ganger høyere aktivering (figur 2B). For å utelukke at resultatene var forårsaket av tap av episomale plasmider, ble RT-qPCR utført for å kvantifisere sgRNA / crRNA relativ overflod in vivo. Resultatene, i figur 2C, D, bekreftet at den episomale vektoren produserte et mye høyere nivå av sgRNA / crRNA enn den integrerende vektoren, uansett ekspresjonssystemet (RGR eller SNR52). Disse resultatene viste at SNR52-systemet kunne fungere enda bedre enn RGR-systemet, og en høyere mengde sgRNA / crRNA i cellen garanterte ikke en høyere aktivering av CRISPR-Cas-systemet. Derfor bør episomale plasmider ikke brukes i konstruksjonen av gendigitale kretser der dCas9/dCas12a-AD brukes.

Stillas RNA engineering
Et scRNA ble konstruert ved å utvide sekvensen av et sgRNA med MS2-hårnålsstrukturer som tillot å rekruttere VP64 AD når det smeltet sammen med MS2-frakkproteinet (MCP, se figur 3A). På denne måten var det ikke nødvendig med prosjektering av, eller modifikasjoner på, dCas9. To MS2-varianter ble prøvd: wt og f6. ScRNA som inneholdt den enkle MS2 hårnålen - 1 × MS2 (vekt) og 1 × MS2 (f6) - ga henholdsvis 5,27 ganger og 4,34 ganger aktivering. Imidlertid returnerte scRNA med en kombinasjon av de to hårnålene - 2 × MS2 (wt + f6) - den generelle høyeste aktiveringen i denne studien (7,54 ganger, se figur 3B). Disse resultatene viste at konstruksjon av et scRNA var langt mer effektivt enn å fusjonere noen aktiveringsdomener til dSpCas9 direkte.

Boolsk port basert på Acr-proteiner
For ytterligere å kontrollere og justere transkripsjonell aktivering av CRISPR-Cas-systemer, ble krets 1 modifisert med innsetting av en fjerde TU for ekspresjon av anti-CRISPR-proteiner (se figur 4A for AcrIIAs og figur 5A for AcrVA). Etter å ha vist at Acrs var effektive, i S. cerevisiae, i motsetning til aktiveringen på grunn av dCas9 / dCas12a-AD, ble en ny krets bygget (se figur 5D) for å teste AcrVA-virkning på dCas12a-baserte repressorer (et tidligere arbeid33 hadde allerede vist at AcrIIAs kunne hemme dCas9-basert gennedregulering). De nye, Acr-holdige små nettverkene fungerte som enkle boolske porter (YES og NOT), noe som kan føre til en restyling av inngangslaget til mer komplekse syntetiske gen-digitale kretser.

AcrIIA4 er en sterk hemmer av dSpCas9
Fire forskjellige promotorer med forskjellige styrker ble brukt til å drive uttrykket av tre typer AcrIIs-AcrIIA2, AcrIIA4 og AcrIIA5. Resultatene viste at de tre AcrIIene virket på en doseavhengig måte i S. cerevisiae. Når de ble uttrykt av en sterk promotor-pGPD, reduserte de fluorescensnivået nådd av dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt + f6) -MCP-VP64 til henholdsvis 0,21, 0,11 og 0,13 av verdien (figur 4B). Siden AcrIIA4 var den eneste som forårsaket høy inhibering av fluorescensuttrykk, selv når den ble produsert av en svak, syntetisk promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA, kunne vi utlede at AcrIIA4 var den sterkeste hemmeren blant de tre AcrIIene. Deretter ble HBD (ER) smeltet til C-enden av AcrIIA4 for å bygge en β-østradiol sensing enhet (se figur 4C). I nærvær av østrogen β-østradiol kan AcrIIA4-HBD (ER) translokere inn i kjernen og deretter nøytralisere funksjonen til den dSpCas9-baserte aktivatoren. Titreringskurven i figur 4D viser at kretsen oppfører seg som en NOT-port med et ON/OFF-forhold som nærmer seg 2,3.

AcrVA er repressorer av dCas12a-proteiner
En NOT-port ble designet og bygget ved å sette inn den pGAL1-drivende AcrVA-uttrykkskassetten i krets 1. På denne måten kan AcrVA-syntese og den påfølgende undertrykkelsen av dCas12a-AD induseres av galaktose (figur 5A). Som vist i figur 5B,C, hindret AcrVA1 både denAsCas12a og dLbCas12a som aktivatorer ved å redusere fluorescensuttrykk fra 19% til 71%, avhengig av kretsskjemaet. AcrVA4 og AcrVA5 kan ikke utøve noen handling på denAsCas12a34. Imidlertid utførte de en sterk hemming av dLbCas12a-baserte aktivatorer ved å redusere fluorescensuttrykk opptil 84% (AcrVA5) og 82% (AcrVA4). I det hele tatt viste AcrVA5 seg å være den mest pålitelige, blant disse tre AcrVA-ene, ved å hemme dLbCas12a-baserte aktivatorer fordi den garanterte, i forskjellige kretser, høyere enn 70% undertrykkelse.

AcrVA1-virkning er konsentrasjonsavhengig
Forholdet mellom AcrVAs in vivo-konsentrasjon og deres hemmende effekter på både aktivatorer og repressorer basert på denAs/dLbCas12a ble også studert. Til dette målet ble hver AcrVA uttrykt under forskjellige promotorer: den sterke pGAL1, den middels sterke pTEF1 og den svake genCYC1t_pCYC1noTATA. Som illustrert i figur 5E, viste AcrVA1 store svingninger i ytelsen avhengig av promotoren som ledet syntesen. AcrVA1 fungerte rimelig bra bare når den ble produsert av pGAL1. Under pTEF1 og genCYC1t_pCYC1noTATA viste AcrVA1 noe undertrykkelse bare på den nakne dLbCas12a. AcrVA4 og AcrVA5 syntes derimot å være mindre følsomme for konsentrasjonen, spesielt ved interaksjon med den nakne dLbCas12a.

Disse dataene viste at AcrVA4 og AcrVA5 generelt presterte bedre enn AcrVA1 når det gjaldt å hemme dLbCas12a-baserte transkripsjonsfaktorer i S. cerevisiae. Det skal bemerkes at AcrVA5 har en merkelig arbeidsmekanisme, siden den virker som et enzym som modifiserer LbCas12a permanent. Imidlertid, som nevnt ovenfor, kan AcrVA5 (sammen med AcrVA4) ikke interagere med denAsCas12a.

Når AcrVA ble uttrykt under pGAL1, blir kretsene enten YES-porter (dCas12a ble smeltet til en AD) eller NOT-porter (bare dCas12a). Førstnevnte så alle svært performant, mens sistnevnte så ut til å fungere bedre i nærvær av AcrVA4 eller AcrVA5.

Figure 1
Figur 1 Transkripsjonsaktivering mediert av dCas9/dCas12a-AD. (A) Krets 1-diagram. De syntetiske promotorene til yEGFP inneholdt seks (6x) og tre (3x) kopier av målsteder for henholdsvis dCas9 eller dCas12a. Etter det kombinerer dCas9/dCas12a-AD med sgRNA/crRNA; Den syntetiske promotoren er målrettet og aktivert på grunn av tilstedeværelsen av aktiveringsdomenene. (B) Den beste aktiveringseffektiviteten til dSpCas9-VP64 ble oppnådd når det var seks lexOp-målsteder på den syntetiske promotoren, og sgRNA ble transkribert av SNR52i. (C,D) Den høyeste aktiveringseffektiviteten til dCas12a-VPR ble oppnådd når tre kopier av lexOp ble satt inn i den syntetiske promotoren, og crRNA ble generert av SNR52i. SNR52i betyr at sgRNA/crRNA ble produsert av pSNR52, og uttrykkskassetten ble plassert inne i en integrerende skyttelvektor. RGRi betyr et integrerende plasmid som er vert for RGR-kassetten for å uttrykke sgRNA / crRNA ble brukt. Den negative kontrollen, "-", representerer et sgRNA / crRNA som inneholder en kryptert avstandssekvens som ikke samsvarer med lexOp-stedet eller med noen sekvens langs gjærgenomet. "bA" indikerer at sgRNA / crRNA binder antisensestrengen til mål-DNA, mens "bS" står for å binde sansestrengen. Hvert fluorescensnivå representerer middelverdien fra minst tre uavhengige eksperimenter (dvs. utført på forskjellige dager). Feilfelt er standardavviket til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av integrerende og episomalt plasmidproduserende sgRNA/crRNA. (A) Aktiveringseffektivitet av dLbCas12a-VPR: crRNA når du målretter mot et enkelt sted på promotoren oppstrøms for yEGFP. (B) dSpCas9-VP64: sgRNA aktivert n× syntetisk promotor ("n" står for antall lexOp-målsteder). (C,D) Normalisert sgRNA / crRNA-ekspresjonsnivå15,16. "i" betyr at sgRNA / crRNA-ekspresjonskassetten ble plassert i en integrerende skyttelvektor, mens "m" står for multikopi (dvs. episomalt) plasmid. "bA"/"bS" indikerer at sgRNA/crRNA binder antisense/sense-strengen til DNA. "ctrl" er en negativ kontroll, hvor en kryptert sgRNA / crRNA ble uttrykt. Hvert fluorescensnivå representerer middelverdien fra minst tre uavhengige eksperimenter (dvs. utført på forskjellige dager). Feilfelt er standardavviket til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Aktiveringseffektiviteten til den nakne dSpCas9 i kompleks med et scRNA. (A) Det skjematiske diagrammet over interaksjonene mellom scRNA, MCP-VP64 og den nakne dSpCas9 16. Den hettelignende strukturen i lilla representerer MCP (MS2 coat protein). En MS2-hårnål (den lilla strukturen i scRNA) kan rekruttere og binde to kopier av MCP. Dermed muliggjør et scRNA ikke bare DNA-binding av dSpCas9, men også aktivering av genuttrykk gjennom rekruttering av MCP-VP64. (B) Aktiveringseffektiviteten til dSpCas9: scRNA-MCP-VP64. Tre typer scRNA ble testet: en som bærer villtype MS2 hårnål-1×MS2 (wt), en annen konstruert med f6 MCP aptamer-1×MS2 (f6), og den siste som inneholder både hårnål-2×MS2 (wt + f6), som viste seg å være den mest effektive. Hvert fluorescensnivå representerer middelverdien fra minst tre uavhengige eksperimenter (dvs. utført på forskjellige dager). Feilfelt er standardavviket til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: AcrIIA-relaterte kretser og resultater. (A) AcrIIA-ekspresjonskassetten ble satt inn i krets 1. Denne ekstra TU inkluderer pGPD som leder uttrykket av AcrIIAs for å motvirke dSpCas9: scRNA_2×MS2 (wt + f6) -MCP-VP64. (B) Inhiberingseffektiviteten til AcrIIAs på den beste dSpCas9-baserte aktivatoren i figur 3B. Den svarte stiplede linjen representerer fluorescensen i nærvær av den dSpCas9-baserte aktivatoren. Tallene over hver kolonne viser inhiberingseffektiviteten beregnet som AV/PÅ-forholdet (dvs. fluorescensnivået i nærvær av AcrIIA delt på fluorescensen i fravær av AcrIIA). I legenden øker styrken til de fire konstituerende promotørene gradvis fra opp til ned. (C) Diagram over β-østradiol sensing enhet (IKKE gate) uttrykker AcrIIA4-HBD (hER). (D) Titreringskurve for kretsen i (C)16. Den grønne kurven refererer til endringen i fluorescens i funksjonell krets. Den svarte kurven ble avledet fra tøyningen uten uttrykket av AcrIIA4-HBD(hER)-den negative kontrollen. Den stiplede linjen i grått markerte fluorescensplatået ved likevekten. Det ble beregnet som gjennomsnittet av fluorescensverdiene ved konsentrasjoner av β-østradiol ikke lavere enn 125 nM. Hvert fluorescensnivå representerer middelverdien fra minst tre uavhengige eksperimenter (dvs. utført på forskjellige dager). Feilfelt er standardavviket til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: AcrVA-relaterte kretser og resultater. (A) AcrVA-uttrykkskassetten ble satt inn i krets 1. Den nye TU inneholder den induserbare promotoren pGAL1 oppstrøms for AcrVA-genene som nøytraliserer arbeidet med dCas12a-AD. Den nye kretsen er en NOT-port regulert av galaktose. (B,C) Resultater fra den galaktoseresponsive NOT-porten i (A). Her driver pGAL1 syntesen av AcrVA, som deretter interagerer med dCas12a-AD15. Den relative fluorescensen tilsvarer AV/PÅ-forholdet. (D) Galaktose-responsiv JA gate. Den benytter AcrVA under kontroll av pGAL1 og den nakne dCas12as som undertrykker syntesen av yEGFP. (E) Sammenligning av inhiberingseffektiviteten til AcrVA uttrykt av promotorer med ulik styrke15. Gruppene "AcrV-effekter på undertrykkelse" og "bare dLb" refererer til kretsen i (D). Gruppene "AcrV-effekter på aktivering" og "dLb-VPR" er resultatene av NOT-porten i (A). Hvert fluorescensnivå representerer middelverdien fra minst tre uavhengige eksperimenter (dvs. utført på forskjellige dager). Feilfelt er standardavviket til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: En liste over alle DNA-sekvenser brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: En liste over primere brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodingsfiler: R-studioskriptet for å analysere FCS-filene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen viste en mulig komplett arbeidsflyt for syntetiske gen-digitale kretser, etter "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologisk ingeniørsyklus og om både tørrlaboratorie- og våtlaboratorieeksperimenter. Her fokuserte vi på CRISPR-Cas-systemet, hovedsakelig dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a og de tilsvarende anti-CRISPR-proteinene, ved å designe og bygge i S. cerevisiae små transkripsjonsnettverk. Noen av dem etterlignet boolske porter, som er de grunnleggende komponentene i digitale kretser. Alle kretser beskrevet her tillot oss å skildre egenskapene og egenskapene til CRISPR-assosierte og anti-CRISPR-proteiner i S. cerevisiae. Disse resultatene er avgjørende for å inkludere disse proteinene i skjemaet for gendigitale kretser.

DBTL-konseptet gir et rammeverk i syntetisk biologi, mens mange optimaliseringer og forbedringer skal gjøres etter testing av en ny artefakt. For eksempel, i krets 1, var det i utgangspunktet bare ett målsted (en kopi av lexOp) for dCas9 / dCas12a-AD på den syntetiske promotoren oppstrøms for yEGFP. Etter å ha testet den kretskonfigurasjonen, fant vi ut at den ikke kunne oppnå mer enn en todelt aktivering15,16. Da antok vi at ved å øke antall eksemplarer av lexOp, som i7, kunne vi nå en høyere transkripsjonsaktivering. Faktisk ble et høyere fluorescensnivå oppnådd ved å bruke tre til seks lexOp-steder (figur 1). Videre forbedret vi ytelsen til kretsene som er vert for dSpCas9 ytterligere ved å konstruere et scRNA, noe som er enklere enn å smelte en eller flere AD-er til et stort protein som dSpCas9 (figur 3). I tillegg, ved å bruke en promotor av forskjellige styrker for å produsere de tre AcrIIAene vi valgte, konkluderte vi med at AcrIIA4 var den sterkeste hemmeren blant dem. Dermed bygde vi en ny NOT-port som reagerte på β-østradiol ved å fusjonere HBD (ER) til AcrIIA4 og utnytte den sterke undertrykkelsen av AcrIIA4 på vår beste dSpCas9-baserte aktivator (figur 4).

På samme måte karakteriserte vi dypt både arbeidet med denAsCas12a og dLbCas12a i gjær og deres interaksjoner med tre AcrVA (figur 5). For hvert dCas12a-AcrVA-par bygde vi en NOT (dCas12a ble smeltet til en AD) og en YES (bare dCas12a) port som reagerer på galaktose. I det hele tatt resulterte dLbCas12a, sammen med AcrVA5, i det beste systemet for å beregne enkle logiske funksjoner.

Metoden beskrevet her presenterte noen kritiske trinn. Alle protein-DNA-sekvenser ble gjærkodonoptimalisert for å sikre høyere ekspresjon i S. cerevisiae. For å unngå uspesifikke mål for dSpCas9/denAsCas12a/dLbCas12a i S. cerevisiae-genomet , valgte vi en bakteriell operator som lexOp. Videre viste stammer som inneholdt GAL1-promotoren en signifikant vekstforsinkelse som kunne begrense anvendeligheten av pGAL1 til syntetiske genkretser15.

Noen modifikasjoner kan også bringes til noen trinn i den overordnede metoden. For å forbedre effektiviteten av fordøyelses-ligeringsprosedyren, er det å foretrekke å fordøye 10 μg (over natten) av både det innsatsholdige plasmidet og akseptorvektorene, i stedet for bare 5 μg på 1 time. På denne måten nås en høyere DNA-konsentrasjon etter elueringstrinnet. Tiden for T4-ligering bør utvides fra 1 time (produsentens protokoll) til 8 timer. Til slutt bør stammer som inneholder dCas12a-VPR-fusjonsproteinet fortynnes etter en 24-timers kultur og dyrkes i ytterligere 12 timer før du kjører et FACS-eksperiment. Under denne tilstanden er variasjonen mellom fluorescensnivåene fra forskjellige celler ikke lenger for høy, og et akseptabelt standardavvik følger med middelverdien av fluorescensintensiteten over en cellepopulasjon.

Oppsummert forklarte denne protokollen hvordan man kan forenkle utformingen av gen-digitale kretser ved å bruke dCas-proteiner og muligens anti-CRISPR-proteiner. Enda viktigere, vi viste i detalj hvordan disse familiene av proteiner fungerer i S. cerevisiae og hvilke av dem som er mest lovende for fremtidig bruk i digitale nettverk. Et uløst problem er koblingen av CRISPR-dCas/anti-CRISPR-systemer og kjemikalier, som representerer kretsinngangene og ikke direkte kan binde dCas-proteiner eller anti-CRISPR-er. Her omgikk vi problemet ved å bruke enten den induserbare GAL1-promotoren eller HBD (ER) festet til AcrIIA4. Imidlertid er en måte å generalisere arkitekturen til kretsinngangslaget nødvendig for å designe syntetiske gendigitale kretser for forskjellige bioteknologiske områder som metabolsk engineering, biosyntese, biosensing, biodiagnostikk og bioremediering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke alle studentene i Synthetic Biology lab-SPST, TJU-for deres generelle hjelp, sammen med Zhi Li og Xiangyang Zhang for deres hjelp i FACS-eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mL PCR 8-strip tubes NEST 403112
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C
1.5 mL Microtubes Axygen MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011150
2 mL Microtubes Axygen MCT-200-C 
50 mL Centrifuge tubes  BIOFIL CFT011500
Agarose-molecular biology grade Invitrogen 75510-019
Ampicillin sodium salt Solarbio 69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler Thermo Fisher Scientific 4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit Axygen AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads BD 650621 Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer  BD -
Centrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Sorvall ST 16R Thermo Fisher Scientific 75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α) Life Technologies 18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent GE Healthcare RPN2235
Electrophoresis apparatus Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd JY300C
Flat 8-strip caps NEST 406012
Gene synthesis company Azenta Life Sciences https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit CWBIO CW2569M Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase) zymoresearch E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope Nikon - Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL Axygen T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL Axygen T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL Axygen T-200-Y-R-S
pRSII403 Addgene 35436
pRSII404 Addgene 35438
pRSII405 Addgene 35440
pRSII406 Addgene 35442
pRSII424 Addgene 35466
pTPGI_dSpCas9_VP64  Addgene 49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase New England Biolabs M0491
Restriction enzyme-Acc65I New England Biolabs R0599
Restriction enzyme-BamHI New England Biolabs R0136
Restriction enzyme-SacI-HF New England Biolabs R3156
Restriction enzyme-XhoI New England Biolabs R0146
Roche LightCycler 96  Roche - Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C - - The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;
MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit SparkJade AG0502 Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler BIO-RAD 186-1096
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
T5 Exonuclease New England Biolabs M0363
Taq DNA ligase New England Biolabs M0208
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) Takara RR820Q
YeaStar RNA kit Zymo Research R1002
β-estradiol Sigma-Aldrich E8875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).
  2. Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).
  3. Mandell, J. G., Barbas, C. F. Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).
  4. Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
  5. Drinnenberg, I. A., et al. RNAi in budding yeast. Science. 326 (5952), 544-550 (2009).
  6. Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates. Nature Communications. 8, 15459 (2017).
  7. Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas. ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).
  8. Nakamura, M., et al. Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells. Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).
  9. Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast. Gene. 131 (1), 129-134 (1993).
  10. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  11. Gao, Y., Zhao, Y. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  15. Yu, L., Marchisio, M. A. Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins. ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).
  16. Zhang, Y., Marchisio, M. A. Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).
  17. Sheff, M. A., Thorn, K. S. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  19. Chee, M. K., Haase, S. B. New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae. G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).
  20. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  21. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. Fourth edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  23. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).
  24. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  25. Zalatan, J. G., et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).
  26. Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits. Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).
  27. Rauch, B. J., et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).
  28. Hynes, A. P., et al. An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9. Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).
  29. Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science. 362 (6411), 236-239 (2018).
  30. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  32. Hahne, F., et al. flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry. BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).
  33. Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae. Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).
  34. Dong, L., et al. An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).

Tags

Retraksjon utgave 188 CRISPR-Cas-systemet dSpCas9 denAsCas12a dLbCas12a type II-A anti-CRISPR-proteiner type V-A anti-CRISPR-proteiner gendigitale kretser Saccharomyces cerevisiae syntetisk biologi
Digitale genkretser basert på CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A.… More

Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter