Summary
BS3 kemisk tvärbindningsanalys avslöjar minskat GABAA-receptoruttryck på cellytan i mushjärnor under kroniska psykosociala stressförhållanden.
Abstract
Ångest är ett tillstånd av känslor som varierande påverkar djurbeteenden, inklusive kognitiva funktioner. Beteendemässiga tecken på ångest observeras över djurriket och kan erkännas som antingen adaptiva eller maladaptiva svar på ett brett spektrum av stressmodaliteter. Gnagare ger en beprövad experimentell modell för translationella studier som behandlar de integrativa mekanismerna för ångest på molekylär, cellulär och kretsnivå. I synnerhet framkallar det kroniska psykosociala stressparadigmet maladaptiva svar som efterliknar ångest- / depressiva beteendefenotyper som är analoga mellan människor och gnagare. Medan tidigare studier visar signifikanta effekter av kronisk stress på neurotransmittorinnehållet i hjärnan, är effekten av stress på neurotransmittorreceptornivåer understuderad. I denna artikel presenterar vi en experimentell metod för att kvantifiera de neuronala ytnivåerna av neurotransmittorreceptorer hos möss under kronisk stress, särskilt med fokus på gamma-aminosmörsyra (GABA) receptorer, som är inblandade i regleringen av känslor och kognition. Med hjälp av den membranogenomträngliga irreversibla kemiska tvärbindaren, bissulfosuccinimidylsuberat (BS3), visar vi att kronisk stress signifikant nedreglerar yttillgängligheten av GABAA-receptorer i prefrontala cortex. De neuronala ytnivåerna av GABAA-receptorer är den hastighetsbegränsande processen för GABA-neurotransmission och kan därför användas som en molekylär markör eller en proxy för graden av ångest-/depressiv-liknande fenotyper i experimentella djurmodeller. Denna tvärbindningsmetod är tillämplig på en mängd olika receptorsystem för neurotransmittorer eller neuromodulatorer uttryckta i vilken hjärnregion som helst och förväntas bidra till en djupare förståelse av mekanismerna bakom känslor och kognition.
Introduction
Neurotransmittorreceptorer lokaliseras antingen på den neuronala plasmamembranytan eller intracellulärt på endomembranen (t.ex. endosomen, endoplasmatisk retikulum [ER] eller trans-Golgi-apparaten) och skyttlar dynamiskt mellan dessa två fack beroende på inneboende fysiologiska tillstånd i neuroner eller som svar på yttre neurala nätverksaktiviteter 1,2. Eftersom nyligen utsöndrade neurotransmittorer framkallar sina fysiologiska funktioner främst genom den ytlokaliserade poolen av receptorer, är ytreceptornivåerna för en given neurotransmittor en av de kritiska determinanterna för dess signalkapacitet inom neuralkretsen3.
Flera metoder finns tillgängliga för att övervaka ytreceptornivåer i odlade neuroner, inklusive ytbiotinyleringsanalys4, immunofluorescensanalys med en specifik antikropp under icke-permeabiliserade förhållanden5 eller användning av en receptortransgen genetiskt smält med en pH-känslig fluorescerande optisk indikator (t.ex. pHluorin)6. Däremot är dessa tillvägagångssätt antingen begränsade eller opraktiska vid bedömning av ytreceptornivåer in vivo. Till exempel kan ytbiotinyleringsförfarandet inte vara praktiskt för bearbetning av stora mängder och provantal hjärnvävnader in vivo på grund av dess relativt höga pris och de efterföljande stegen som är nödvändiga för att rena de biotinylerade proteinerna på avidinkonjugerade pärlor. För neuroner inbäddade i tredimensionell hjärnarkitektur kan låg antikroppstillgänglighet eller svårigheter med mikroskopbaserad kvantifiering utgöra en signifikant begränsning för att bedöma ytreceptornivåerna in vivo. För att visualisera fördelningen av neurotransmittorreceptorer i intakta hjärnor kan icke-invasiva metoder, såsom positronemissionstomografi, användas för att mäta receptorbeläggning och uppskatta ytreceptornivåerna7. Detta tillvägagångssätt bygger dock kritiskt på tillgången på specifika radioligander, dyr utrustning och specialkompetens, vilket gör den mindre tillgänglig för rutinmässig användning av de flesta forskare.
Här beskrivs en enkel, mångsidig metod för att mäta ytreceptornivåer i experimentella djurhjärnor ex vivo med hjälp av en vattenlöslig, membranogenomtränglig kemisk tvärbindare, bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)8,9. BS3 riktar sig mot primära aminer i sidokedjan av lysinrester och kan kovalent tvärbinda proteiner i närheten av varandra. När hjärnskivor nyligen framställs från en region av intresse och inkuberas i en buffert innehållande BS3, korsbinds cellytereceptorerna med närliggande proteiner och omvandlas sålunda till arter med högre molekylvikt, medan de intracellulära endomembranassocierade receptorerna förblir omodifierade. Därför kan yt- och intracellulära receptorpooler separeras med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och kvantifieras med western blot med användning av antikroppar specifika för receptorn som ska studeras.
Oförutsägbar kronisk mild stress (UCMS) är ett väletablerat experimentellt paradigm för att inducera kronisk psykosocial stress hos gnagare10. UCMS framkallar ångest-/depressiva-liknande beteendefenotyper och kognitiva underskott via modulering av en rad neurotransmittorsystem, inklusive GABA och dess receptorer10,11. I synnerhet är α5-subenhetsinnehållande GABA A-receptorn (α5-GABAA R) inblandad i regleringen av minne och kognitiva funktioner12,13, vilket tyder på möjlig involvering av förändrade funktioner hos denna underenhet i UCMS-inducerade kognitiva underskott. I detta protokoll använde vi BS3-tvärbindningsanalysen för att kvantifiera nivåer av ytuttryckt α5-GABAAR i prefrontala cortex hos möss som exponerats för UCMS jämfört med icke-stressade kontrollmöss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurarbete i detta protokoll slutfördes i enlighet med Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, kapitel A.22) och Canadian Council on Animal Care (CCAC) och godkändes av Institutional Animal Care Committee.
1. Beredning av djur
- Bestäm djurantalet som ska användas i experimenten och dela upp dem i lämpliga grupper eller experimentella kohorter. Se diskussionsavsnittet för en diskussion om gruppstorlek, kön och statistisk styrka.
OBS: Detta protokoll är anpassat för möss (C57BL6 / J-stam; 2-4 månaders ålder; vanligtvis 20-30 g kroppsvikt; motsvarande antal män och kvinnor som ska användas). - Placera djuren under UCMS eller kontrollera icke-stressade förhållanden i 5-8 veckor, enligt protokollet som beskrivits tidigare14.
- Efter det sista UCMS-förfarandet, låt djuren stanna i sina hemburar i 1 dag innan de används för tvärbindningstestet för att undvika akuta stresseffekter på receptoruttrycket.
2. Beredning av stamlösningarna
- Bered och lagra följande lösningar enligt instruktionerna före analysen.
- Bered 5 M NaCl genom att lösa 14,6 g NaCl i 40 ml avjoniserat vatten. Förvaras i rumstemperatur (RT).
- Bered 1,08 M KCl genom att lösa 3,22 g KCl i 40 ml avjoniserat vatten. Förvara på RT.
- Bered 400 mM MgCl2 genom att lösa 3,25 g MgCl2·6H2O i 40 ml avjoniseratvatten. Förvara på RT.
- Bered 1 M glycin genom att lösa 3 g glycin i 40 ml avjoniserat vatten och förvara vid 4 °C.
- Bered 1 M ditiotreitol (DTT) genom att lösa 1,54 g DTT i 10 ml avjoniserat vatten. Filtrera det genom ett filter med en porstorlek på 0,2 μm och alikvot i 2 ml rör. Förvaras vid −20 °C.
- Förbered 10% Nonidet-P40 (NP-40) genom att späda den i förhållandet 1:10 (v / v) i avjoniserat vatten. Förvara på RT.
- Förbered 0,5 M EDTA (pH = 8,0) och förvara vid RT.
- Bered 1 M HEPES-buffert (pH = 7,2-7,5) och förvara vid 4 °C.
- Bered 2,5 M eller 45 % (vikt/volym) glukos och förvara vid 4 °C.
3. Förberedelse av arbetsstationen
- På dagen för BS3-tvärbindningstestet samlas följande material i djurdissektionsrummet (figur 1), med flera föremål förkylda på is: en ishink, ett metalltemperaturblock (förkylt på is), iskall PBS i ett 50 ml koniskt rör och fryst PBS i en petriskål, filterpapper fuktat med PBS och placerat på en kyld plan yta eller blå is, en hjärnmatris (1 mm intervall för insättning av rakblad) förkyld på is, rakblad (~ 10) förkyld på is, dissektionsverktyg (sax, pincett, en böjd sond), en mjukstans, 70% etanolspraytorkningspapper och pappershanddukar, pipetspetsar (200 μL), en pipettor (P200), ett stoppur, en memoplatta, en penna och mikrocentrifugrör (1,5 ml).
- Före analysen, märk mikrocentrifugrören med provinformationen (t.ex. djur-ID-nummer, behandlingstyp [UCMS versus no stress (NS)], hjärnregion, med eller utan BS3, etc.).
OBS: För BS3-tvärbindningsanalyserna måste två prover från varje hjärnregion samlas in; ett prov kommer att användas för tvärbindning (med BS3) och det andra för icke-tvärbindningsreaktionen (utan BS3) som en kontroll. För att ta prov från två hjärnregioner (dvs. prefrontala cortex [PFC] och hippocampus [HPC]) på 12 möss, märk därför 48 rör för initial provtagning (= 2 prover × 2 regioner × 12 möss) (som ska användas i avsnitt 6). Märk ytterligare två uppsättningar med 48 rör för senare lagring (för lagring av två olika volymer [100 μl, 300 μl] av varje prov) (som ska användas i avsnitt 7). Således är det nödvändigt att märka totalt 144 rör för denna kohortstorlek.
- Före analysen, märk mikrocentrifugrören med provinformationen (t.ex. djur-ID-nummer, behandlingstyp [UCMS versus no stress (NS)], hjärnregion, med eller utan BS3, etc.).
- Se dessutom till att följande utrustning finns tillgänglig i laboratoriet: en kyld mikrocentrifug på bordsskivan, en ultraljudsator, en rörrotator (som ska användas i kylrummet eller inuti kylskåpet [4 °C]), en frys (−80 °C) för förvaring av prover och en hink torris för tillfällig lagring av proverna (som ska användas i avsnitt 7)
4. Förberedelse av arbetslösningar och buffertar
OBS: På morgonen för analysen, förbered följande lösningar. Denna beräkning baseras på nödvändiga lösningar för att bearbeta två hjärnregioner (dvs. PFC och HPC) från 12 möss.
- Bered artificiell cerebrospinalvätska (aCSF, pH = 7,4) enligt tabell 1. Fördela 750 μl aCSF i varje provtagningsrör (de 48 rören märkta i steg 3.1.1) och placera dem i metalltemperaturblocket på is för att förkyla bufferten.
- Bered lysbufferten enligt tabell 2. Förvaras på is (400 μL används per prov).
- Bered en 52 mM BS3 stamlösning (26x) i 5 mM natriumcitratbuffert (pH = 5,0).
- Förbered först 100 mM citronsyra (lager A) och 100 mM natriumcitrat (lager B).
- Späd lager A och lager B i förhållandet 1:20 med avjoniserat vatten. Tillsätt 100 μl vardera till 1,9 ml vatten för att bereda 5 mM citronsyra (lager C) respektive 5 mM natriumcitrat (lager D).
- Blanda 410 μl lager C och 590 μl lager D för att bereda en 5 mM natriumcitratbuffert (pH = 5,0) (lösning E, 1 ml).
- Bekräfta pH-värdet i lösning E med hjälp av en pH-indikatorremsa.
- Lös 24 mg BS3 i 806,4 μl E-lösning genom virvling i 30 s för att bereda stamlösningen BS3 (26x).
- Bered ytterligare 1 ml E-lösning som vehikelkontroll för proverna utan tvärbindning.
OBS: Förbered BS3 stamlösning när allt annat är klart och experimentet är på väg att börja. BS3 ska förvaras torkat vid 4 °C fram till användning. Efter beredning förblir BS3 aktiv endast i cirka ≤3 timmar. Eftersom pH-värdet i 5 mM natriumcitratbufferten (lösning E) rapporteras stiga med tiden, vilket orsakar accelererad BS3-hydrolys, rekommenderas att lösning E bereds färsk från stamlösningarna A och B9. På grund av den begränsade lösligheten av BS3 vid låga temperaturer, behåll den rekonstituerade BS3 vid rumstemperatur. Använd upp den rekonstituerade BS3 på 3 timmar och frys/tina inte och återanvänd inte den rekonstituerade BS3.
5. Dissektion av hjärnvävnader
OBS: Från och med detta steg bör minst två personer arbeta tillsammans på ett samordnat sätt. Medan en person fokuserar på djurdissektionen (steg 5.2-5.10 och steg 6.3), bör den andra personen arbeta som tidtagare och hjälpa till att samordna analysen (steg 5.1, steg 6.1, steg 6.2, steg 6.4 och steg 6.5)
- Ta med det första djuret för dissektion från bostadsområdet till dissektionsrummet.
OBS: Eftersom akuta stressfaktorer (t.ex. en ny miljö, lukten av blod) kan påverka hjärnans proteindynamik, bör djuren hållas i sina hemburar placerade långt från dissektionsområdet och sedan föras individuellt in i dissektionsrummet för omedelbar halshuggning. - Avliva musen genom cervikal dislokation följt av halshuggning. Ta bort hjärnan snabbt ur skallen och sänk ner den i iskall PBS i en petriskål i 10-15 s (figur 2).
OBS: Djuren bedövas inte för BS3-experiment eftersom något bedövningsmedel potentiellt kan påverka ytpresentationsnivån hos neurotransmittorreceptorerna9. - Placera den kylda hjärnan i hjärnmatrisen på is, med hjärnans ventrala sida uppåt (figur 3).
- Sätt in det första rakbladet genom gränsen mellan luktlampan och luktbenet för att skära hjärnan koronalt (figur 4). Använd tre till fyra extra rakblad, skär seriellt den främre delen av hjärnan koronalt med 1 mm intervall.
- Lyft koronaskivorna från hjärnmatrisen genom att hålla ihop alla insatta rakblad och lämna den bakre delen av hjärnan bakom i hjärnmatrisen. Använd pincett för att separera rakbladen från varandra och placera dem på den plana, kylda ytan med hjärnskivan uppåt (figur 5).
- Identifiera segmenten som innehåller det intressanta området. För provtagning av PFC, välj den andra och tredje skivan bakom den första skivan som innehåller luktpedunkeln.
- Ta bort det intressanta området med hjälp av en vävnadstans (Video 1), lägg det åt sidan på det kylda rakbladet och dela vävnaden jämnt i två (t.ex. vävnader från vänster kontra höger halvklot, med ena halvan som ska användas för BS3-tvärbindningsreaktionen och den andra halvan för kontrollen utan tvärbindning om målproteinet av intresse uttrycks lika i båda halvklotet).
- Finhacka varje vävnad i bitar på rakbladet med hjälp av den fina spetsen av pincett med flera vertikala rörelser mot bladet (Video 2) istället för att mosa eller slipa vävnaderna. Detta maximerar ytan som är tillgänglig för BS3 utan att allvarligt äventyra cellernas membranintegritet. Omedelbart efter malning, överför de malda vävnaderna till lämpliga rör (se steg 6.3).
- För provtagning av HPC, ta ut den bakre delen av hjärnan ur matrisen och placera hjärnan på fuktat filterpapper på den kylda plana ytan, med ryggsidan uppåt (figur 6).
- Använd en böjd sond och pincett och närma dig från ryggsidan (Video 3), dissekera HPC (dorsal halva, ventrala halvan eller båda) från båda halvkloten (ena halvan för BS3-tvärbindning och den andra halvan för kontrollen). Finhacka varje vävnad enligt steg 5.8 och överför vävnaden till lämpliga rör (se steg 6.3).
OBS: Hela dissektionstiden för varje djur bör hållas på ~ 5 min för att försöksbetingelserna och resultaten ska vara konsekventa.
6. Tvärbindning reaktion
- Ta med nästa djur för dissektion från bostadsområdet till dissektionsrummet när dissektionen av hjärnan hos föregående mus håller på att avslutas (steg 5.10).
- Spetsa röret förkylt på is (från steg 4.1) med 30 μl BS3-lösning (26x) eller vehikellösning E precis innan de malda vävnaderna är redo att överföras till lämpliga rör. Byt pipettspetsarna mellan rören för att säkerställa att ingen BS3 är förorenad i kontrollrören utan tvärbindning.
- Överför de malda vävnaderna (från steg 5.8 och steg 5.10) till lämpliga rör och börja sedan dissekera nästa djur (steg 5.2)
- Vänd upp och ned och blanda röret för att bryta isär vävnadsbitarna i mindre bitar (Video 4) och börja inkubera proverna på rörrotatorn i kylrummet i 30 minuter till 2 timmar. Registrera starttiden för BS3-inkubationen för varje rör. Se diskussionsavsnittet för optimal inkubationstid.
- Släck reaktionen genom att spetsa röret med 78 μl 1 M glycin och inkubera provet ytterligare i 10 minuter vid 4 °C med konstant rotation. Anteckna start- och sluttid för släckning för varje rör. Fortsätt hjälpa personen som fokuserar på djurdissektionen genom att ta med nästa djur (steg 6.1) och hjälpa till med tvärbindning (steg 6.2).
OBS: Behandla varje prov med exakt samma tidpunkt över alla prover. Om dissektionsrummet ligger långt ifrån kylrummet rekommenderas det starkt att en tredje person rekryteras för att delta i provinkubationen och släckningen i kylrummet.
7. Vävnadslys, proteinberedning och western blot
- Efter 10 minuters kylning (steg 6.5), snurra proverna vid 20 000 x g vid 4 °C i 2 minuter och kassera supernatanten. Om en tredje person är tillgänglig, fortsätt till steg 7.2. I annat fall, snäppfrys proverna på torris och pausa testet här tills hjärndissektion (avsnitt 5) och tvärbindning (avsnitt 6) för alla djur är klara.
- Tillsätt 400 μL iskall lysbuffert per rör.
- Sonicate proverna för 1 s fem gånger med 5 s intervall däremellan, samtidigt som proverna hålls på is.
- Snurra prover vid 20 000 x g i 2 minuter för att spinna ut olösligt vävnadsskräp (pellet) och spara supernatanten.
- Använd 5 μl av supernatanten för att mäta proteinkoncentrationen med hjälp av bicinchoninsyra-testet (BCA).
- Dela resten av supernatanten i två rör; ett rör innehåller 100 μL supernatant för den efterföljande västra blottan, och det andra röret innehåller resten (~ 300 μL) för långtidsförvaring vid −80 ° C. Tillsätt en lämplig mängd 4x SDS-provbuffert (kompletterad med β2-merkaptoetanol) till proverna och inkubera vid 70 °C i 10 minuter.
- Kör 10-20 μg protein per brunn på en akrylamidgel för elektrofores (SDS-PAGE) och överför sedan proteiner till polyvinylidenfluoridmembranet (PVDF) för western blot-analys.
- Blockera PVDF-membranet i 5 % (vikt/volym) skummjölk upplöst i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,1 % Tween-20 (TBS-T) i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet kortvarigt två gånger med TBS-T och inkubera det med den primära antikroppen utspädd i TBS-T över natten vid 4 °C.
- Tvätta bort den primära antikroppen tre gånger i 10 minuter vardera i TBS-T vid RT.
- Inkubera membranet med pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp utspädd i TBS-T i 1 timme vid RT.
- Tvätta bort den sekundära antikroppen tre gånger i 10 minuter vardera i TBS-T vid RT.
- Inkubera membranet i förstärkt kemiluminiscensreagens och detektera signalen med hjälp av geldokumentationsapparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera genomförbarheten av BS3-tvärbindningsanalysen för utvärdering av ytan α5-GABA A R-nivåer i musen PFC, körde vi 10 μg vardera av BS3-tvärbundna och icke-tvärbundna proteinprover på SDS-PAGE och analyserade proteinerna med western blot med hjälp av en anti-α5-GABAAR-antikropp (kaninpolyklonal) (figur 7). De icke-tvärbundna proteinproverna gav den totala mängden α5-GABA A R vid ~ 55 kDa, medan BS3-tvärbundna proteinprover gav en viss mängd endomembranassocierad α5-GABA AR(migrerande vid ~ 55 kDa) tillsammans med proteinarter med högre molekylvikt som representerar proteinkomplex kovalent tvärbundna till α5-GABAAR. För kvantifiering av ytan α5-GABA A R-nivåer kan vi bedöma graden av utarmning av α5-GABAAR vid ~ 55 kDa från den totala poolen vid tvärbindning, eftersom underenheten sedan skiftar till positioner med högre molekylvikt. I praktiken kan ytnivåerna av α5-GABA A Rberäknas genom att subtrahera mängden endomembranassocierad α5-GABA A R (vid ~ 55 kDa i den tvärbundna provbanan) från de totala α5-GABAAR-nivåerna (vid ~ 55 kDa i den icke-tvärbundna provbanan).
Därefter utvärderade vi effekterna av UCMS (vid 3 veckor och 5 veckor) på ytan och totala α5-GABAAR-nivåer i PFC hos mus. I detta experiment, för att följa tidsförloppet för tvärbindningsreaktionen, förberedde vi proverna vid 1 h, 2 h och 3 h efter tillsatsen av BS3. Eftersom BS3-tvärbindningsreaktioner tycktes nå en platå vid 2 timmar, användes data vid 1 h-tidpunkten för att plotta grafen. Vi observerade en signifikant och progressiv minskning av α5-GABAAR-nivåerna på ytan i produktfunktionskategorin vid 3 veckor och 5 veckor med UCMS, jämfört med möss utan stresskontroll (figur 8). Data visade försumbara eller inga uppenbara förändringar i de totala receptornivåerna under dessa experimentella förhållanden, vilket tyder på att kronisk stress specifikt påverkade α5-GABAAR-handeln till cellytan.
Figur 1: Dissektionsverktyg som används i BS3-tvärbindningsanalysen. Filterpapper fuktas med iskall PBS och placeras på den plana ytan av blå is. En petriskål fylld med PBS och lagrad vid −20 °C 1 dag före analysen läggs på is. Hjärnmatrisen och rakbladen är förkylda på is. Sax (en stor, en liten), pincett (en stor, några små) och en vävnadstans rengörs alla före analysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hela mushjärnan dissekeras ur skallen och placeras i iskall PBS. Omedelbart efter att hela hjärnan avlägsnades från skallen sänktes den i iskall PBS i 10-15 s i en petriskål på is. Detta saktar ner hjärnans ämnesomsättning och minimerar proteinhandeln och nedbrytningen samtidigt som det hjälper vävnaden att bli hårdare, vilket gör den efterföljande hjärnskivningen lättare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: En mushjärna placerad i hjärnmatrisen. Den kylda mushjärnan nedsänkt i iskall PBS överfördes till hjärnmatrisen och placerades med den ventrala sidan uppåt. Rakbladen och matrisen förkyldes på is. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Koronal snittning av en mushjärna i hjärnmatrisen. Det första förkylda rakbladet sattes in genom gränsen mellan luktbulben och luktpeduncle för att börja sektionera hjärnan koronalt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Seriella koronala sektioner av en mushjärna. Den främre delen av mushjärnan skars koronalt genom att fem rakblad sattes in i serie i hjärnmatrisen (1 mm intervall). Alla de insatta bladen hölls ihop, lyftes av matrisen, separerades från varandra med hjälp av pincett och placerades på den kylda plana ytan med hjärnskivan uppåt. (Överst till vänster) Den olfaktoriska glödlampan; (mitten till vänster) det första avsnittet; den andra (nedre vänstra) och tredje (övre högra) sektionen användes för provtagning av PFC-vävnaderna; (nere till höger) det fjärde avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bakre delen av hjärnan för dissekering av hippocampus. Efter att den främre delen av hjärnan skars koronalt med rakblad (vänster), togs den bakre delen av hjärnan (mitten) ut ur hjärnmatrisen och placerades på PBS-fuktat filterpapper på den kylda ytan (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: BS3-tvärbindning av GABAAR på cellytan. I närvaro av BS3 är α5-GABA A R på plasmamembranytan tvärbunden (XL) med anonyma proteiner nära den, såsom andra GABA A R-subenheter inom denpentameriska GABAAR-enheten eller ytterligare angränsande proteiner(X), men inte med proteiner (Y) långt ifrån den. Således framträder α5-GABAAR som en proteinart med hög molekylvikt (HMW) på fläcken. α5-GABAAR på endosomen förblir intakt och migrerar med den förväntade storleken ~55 kDa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Ytnivåer α5-GABAAR som påverkas av UCMS. Både den totala nivån och ytnivån av α5-GABAAR i PFC hos möss under förhållanden utan stress och UCMS (3 veckor och 5 veckor) utvärderades. För att följa tvärbindningsreaktionens tidsförlopp bereddes proverna vid 1 h, 2 h och 3 h efter tillsats av BS3. Honmöss (2-3 månader, N = 4/grupp) användes. De intakta α5-GABA A R-nivåerna vid 55 kDa för varje tillstånd normaliserades först med motsvarande αtubulinnivåer och användes sedan för att beräkna de totala och endomembranassocierade α5-GABAAR-nivåerna (från de tvärbundna [No Xlink] respektive tvärbundna [Xlink]-proverna). Därefter beräknades ytreceptornivåerna genom att subtrahera den endomembranassocierade mängden från de totala nivåerna. Eftersom BS3-tvärbindningsreaktionerna tycktes nå en platå med 2 timmar, användes data vid 1 h-tidpunkten för att plotta grafen (medelvärde ± SEM). Signifikanta effekter av kronisk stress på ytan α5-GABAAR-nivåer observerades, och denna effekt var UCMS varaktighetsberoende, eftersom en progressiv minskning av ytan α5-GABAAR-nivåer identifierades under UCMS-perioden. *p < 0,05, **p < 0,01 (Kruskal-Wallis-test med Dunns multipla jämförelser). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Arbeta konc. | Stamlösning | Mängd stamlösning som ska dispenseras |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 m (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM glukos | 2,5 m (250x) | 160 μL |
| Avjoniserat vatten | 37,563 ml | |
| Total | 40 ml | |
| * CaCl2-beståndet bör vara nyberett på experimentdagen. | ||
Tabell 1: Sammansättningen av artificiell cerebrospinalvätska.
| Arbeta konc. | Stamlösning | Mängd stamlösning som ska dispenseras |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 m (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 m (250x) | 80 μL |
| 1 mM DTT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Cocktail för proteashämmare | 100x | 200 μL |
| Avjoniserat vatten | 17 ml | |
| Total | 20 ml |
Tabell 2: Lysbuffertens sammansättning
Video 1: Isolera PFC med en vävnadstans. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Hacka PFC med pincett. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Dissekera HPC med hjälp av en böjd sond och pincett. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: Inversion-blandning av ett vävnadsprov. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om effekterna av kronisk psykosocial stress på beteenden (dvs. emotionalitet och kognitiva underskott) och molekylära förändringar (dvs. minskat uttryck av GABAerga gener och åtföljande underskott i GABAergisk neurotransmission) är väldokumenterade10, behöver mekanismerna bakom sådana underskott undersökas ytterligare. I synnerhet, med tanke på den senaste studien som visar att kronisk stress signifikant påverkar det neuronala proteomet genom överbelastning på ER-funktionerna och därmed förhöjd ER-stress15, kvarstår en fråga om huruvida kronisk stress påverkar GABAA R-handel genom ER-membranet och hur förändrad handel eller ytnivåer av GABAAR kan vara kausalt kopplad till psykopatologi.
BS3-tvärbindningsanalysen som visas i detta protokoll kommer att fungera som en kraftfull metod för att svara på några av dessa frågor. Till exempel är UCMS känt för att framkalla en serie beteendeförändringar, inklusive kognitiva underskott, ångestliknande beteende och anhedoniska fenotyper, beroende på varaktigheten av UCMS10. Därför skulle det vara möjligt att studera tidsförloppet och graden av UCMS-inducerade förändringar i ytan α5-GABAAR-nivåer genom provtagning av mushjärnor vid successiva tidpunkter från början av UCMS (t.ex. 1 vecka, 3 veckor, 5 veckor), och det skulle också vara möjligt att jämföra med de beteendefenotyper som observerats vid varje tidpunkt. Ytterligare GABAAR-subtyper (t.ex. α1, α2) och receptorn för neuromodulatorer som är kända för att påverkas av kronisk stress (t.ex. TrkB receptorn för hjärnhärledd neurotrofisk faktor [BDNF])10 kunde testas samtidigt med samma prover. Eftersom vissa av dessa receptorsystem och subtyper är selektivt inblandade i specifika beteendedomäner (t.ex. sedering, ångest, kognition)11, är det värt att korrelera beteendeförändringarna med typen och graden av receptorer som påverkas av UCMS vid varje tidpunkt.
Nedan följer de kritiska punkterna att tänka på för flera steg i protokollet. Det första steget är att bestämma det nödvändiga och tillräckliga antalet djur att använda baserat på experimentell design och effektanalys. Till exempel, för att studera effekten av kronisk stress på ytan GABAA-receptornivåer, förbereder vi rutinmässigt en grupp möss (N = 6 / kön) för att utsättas för UCMS i 5 veckor och en annan grupp (N = 6 / kön) för att hållas under stressfria förhållanden. Denna gruppstorlek (N = 24 totalt, inklusive båda könen) förväntas ge tillräcklig statistisk styrka för att detektera en ~ 20% skillnad i receptornivåer, vilket möjliggör utvärdering av både stresseffekter och sexeffekter. I synnerhet rapporteras att kronisk stress orsakar könsberoende skillnader i beteendemässiga och molekylära resultat10. Till exempel är kvinnor i allmänhet mer benägna att utveckla depressiva symtom än män. Konsekvent indikerar våra studier med mänskliga postmortem och gnagare hjärnor högre nivåer av beteendemässiga och molekylära patologier hos kvinnliga ämnen; nedreglerade nivåer av somatostatin (SST), en molekylär markör för depression, är mer robusta hos kvinnor bland deprimerade patienter16, och ökad känslighet är mer robust i kvinnliga musmodeller som replikerar aspekter av depressiv patologi än hos män15,17. Därför rekommenderas att varje experimentell design som behandlar effekterna av kronisk stress på psykopatologiska resultat bör innehålla tillräckligt antal både män och kvinnor för att säkerställa statistisk styrka vid analys av data och för att identifiera möjliga könsberoende effekter.
Den optimala inkubationstiden med BS3 bör bestämmas i pilotexperiment för varje receptor som ska studeras. Det rapporteras att receptorhandel kan ske långsamt, även vid låga temperaturer under provinkubation9. För att fånga exakta ytreceptornivåer vid tidpunkten för hjärndissektion skulle det vara idealiskt att minimera inkubationstiden och välja tidpunkten precis innan tvärbindningsreaktionen når platån (30 min till 2 h vid 4 ° C).
Vi märkte flera operativa begränsningar i samband med BS3-tvärbindningsanalyser. (1) För det första, på grund av den relativt korta halveringstiden (2-3 timmar) för BS3 orsakad av spontan hydrolys inom det fysiologiska pH-området, måste man slutföra djurdissektion och tvärbindningsreaktion inom denna tidsram. Detta ledde till att vi begränsade antalet djur vi kunde dissekera åt gången till högst 12. Om försöksledaren planerar att dissekera mer än 12 djur rekommenderas det att dela upp försökskohorten i flera grupper, var och en innehåller mindre än 12 djur. När analysen för en grupp har slutförts bör en ny sats BS3 förberedas för att användas i efterföljande tvärbindningsanalyser för nästa grupp. På samma sätt bör antalet intressanta regioner som ska dissekeras från ett djur begränsas. Vi samplar rutinmässigt från två hjärnregioner (PFC, HPC) för tvärbindningsanalysen, och detta är det maximala antalet hjärnregioner vi kan dissekera för att få konsekventa resultat med minimal variation mellan prover. (2) För det andra bör specificiteten hos de antikroppar som används i western blot utvärderas noggrant. Den kemiska tvärbindningsreaktionen BS3 kan ha en oväntad effekt på antigeniciteten hos proteinerna som detekteras av varje antikropp. Vi fann att en α5-GABAAR-antikropp (specificerad i Tabell över material) detekterade felaktigt ett starkt ~ 50 kDa-band specifikt i BS3-tvärbundna prover, oavsett närvaro eller frånvaro av α5-GABAAR-protein i provet. detta ~ 50 kDa-band sågs även i vävnadsprover från α5-GABAAR-knockoutmöss, vilket tyder på att denna antikropp började korsreagera med irrelevanta antigener som oavsiktligt genererades av BS3-tvärbindningsreaktionen. Det rekommenderas att antikroppsspecificiteten bestäms noggrant med och utan BS3-tvärbindningsreaktioner, helst med hjälp av knockoutvävnadsprover, om sådana finns tillgängliga, för ett givet protein av intresse. (3) Det nuvarande protokoll som beskrivs här behandlar inte de celltyper där varje GABAAR-subtyp uttrycks (t.ex. neuroner och astrocyter). För vissa GABAAR-subtyper (t.ex. α1, α5) som huvudsakligen uttrycks i neuroner18bör tvärbindningsanalysdata som erhållits med hjälp av hjärnvävnader i bulk, enligt beskrivningen i detta protokoll, ge information som återspeglar de neuronala ytnivåerna. Men för andra GABAAR-subtyper (t.ex. α2) som uttrycks starkt i både neuroner och astrocyter18är det av intresse att studera receptorytnivåerna i nervceller kontra astrocyter separat. För detta ändamål konventionell cellsortering (t.ex. fluorescensaktiverad cellsortering [FACS]19) får integreras i BS3-tvärbindningsprotokollet. celldissociationssteget för cellsortering kan göras efter BS3-släckningssteget, men man måste validera att alla procedurer och villkor för FACS (t.ex. buffertar som ska användas, temperatur, inkubationstid) är kompatibla med dem i tvärbindningsanalysen. Dessutom får FACS-metoden endast användas för GABAAR-subtyper som är kända för att vara lokaliserade till det perisomatiska cellulära facket (t.ex. α2) men inte för de subtyper som anrikats med distala dendriter (t.ex. α5)18, eftersom perifera eller distala cellfack sannolikt går förlorade under det omfattande celldissociationssteget som är nödvändigt för cellsortering. (4) Slutligen fann vi att resultaten var mer konsekventa när vi beräknade ytreceptornivåerna genom att subtrahera mängden endomembranassocierade receptorer från den totala mängden receptorer snarare än att direkt utvärdera ytnivåerna baserat på densitometri av proteinarter med hög molekylvikt. Detta beror sannolikt på att överföringseffektiviteten hos dessa proteinarter med hög molekylvikt på PVDF-membranet är mer variabel än för det ursprungliga, intakta proteinet av mindre storlek (t.ex. ~ 55 kDa för α5-GABAAR). Det rekommenderas därför att följa metoden som beskrivs i resultatavsnittet och förklaringen till Figur 8 för att beräkna ytreceptornivåerna.
Förutom effekterna av kronisk stress på GABAAR kan BS3-tvärbindningsanalysen också tillämpas på genetiskt modifierade möss eller gnagarmodeller med experimentella manipulationer för att undersöka ett antal neurologiska eller neuropsykiatriska tillstånd. Denna analys har framgångsrikt använts för att fånga kokaininducerade effekter på ytuttrycket av glutamatreceptorer i kärnan accumbens av råtthjärnor20,21. Analysen har också använts för att visa minskat ytuttryck av α5-GABAAR i PFC hos heterozygota BDNF-knockoutmöss22. I en annan tidigare studie, i modellen för hepatisk encefalopati hos råttor, var de medföljande rumsliga inlärningsunderskotten kausalt kopplade till förändrat ytuttryck av glutamat och GABAA-receptorer baserat på denna tvärbindningsanalys23. Sammanfattningsvis ger BS3 kemisk tvärbindningsanalys ett mångsidigt verktyg för att fånga hjärnregionspecifika och kontextberoende förändringar i en rad receptorsystem i hjärnan, liksom i praktiskt taget alla andra perifera vävnader eller organ. Denna analys kan också utföras parallellt med andra metoder för att utvärdera ytreceptornivåerna, såsom elektrofysiologisk registrering av tonisk hämning (särskilt i fallet med α5-GABAAR), kryogen elektronmikroskopi och ytbiotinylering, för att jämföra och validera resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar CAMH-djuranläggningens personal för att ta hand om djuren under studietiden. Detta arbete stöddes av Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 till TT), Discovery Fund från CAMH (till TP), National Alliance for Research on Schizofreni och depression (NARSAD award # 25637 till ES) och Campbell Family Mental Health Research Institute (till ES). E.S. är grundare av Damona Pharmaceuticals, ett biopharma dedikerat till att föra nya GABAergic föreningar till kliniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E.
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
