अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एमआरएनए और बिसल्फाइट-एमआरएनए लाइब्रेरी की तैयारी का संवर्धन
Summary
यह प्रोटोकॉल रुचि के जैविक नमूने के लिए मानकीकृत उपकरणों का उपयोग करके पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण, बाइसल्फाइट रूपांतरण और पुस्तकालय तैयारी का संचालन करने के लिए एक आसान-से-पालन वर्कफ़्लो प्रदान करता है।
Abstract
विभिन्न प्रकार के आरएनए प्रतिलेख में आरएनए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में विविध आरएनए विनियमन से जुड़े होते हैं। असामान्य आरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन और आरएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ की अनियमित अभिव्यक्ति को कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन पर बिसल्फाइट-परिवर्तित आरएनए में स्थितियों और मात्रात्मक साइटोसिन मिथाइलेशन स्तरों को चिह्नित करने के लिए ट्रांसक्रिपटम-वाइड बिसल्फाइट-अनुक्रमण विकसित किया गया था। यहां, यह प्रोटोकॉल पॉली (ए) आरएनए शुद्धिकरण के दो दौरों, बिसल्फाइट प्रतिक्रिया के तीन चक्रों और एमआरएनए 5-मिथाइलसाइटोसिन संशोधन साइटों के ट्रांसक्रिपटम-वाइड मैपिंग की अनुमति देने के लिए पुस्तकालय की तैयारी की प्रक्रियाओं को विस्तार से प्रस्तुत करता है। मुख्य प्रतिक्रिया के बाद आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन आरएनए अखंडता की निगरानी के लिए आवश्यक है और उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण पुस्तकालयों को सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। आदर्श रूप से, प्रक्रियाओं को तीन दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, इनपुट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए का उपयोग व्यावहारिक रूप से रुचि के नमूने से अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मजबूत बिसल्फाइट-एमआरएनए पुस्तकालयों का निर्माण कर सकता है।
Introduction
150 से अधिक प्रकार के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों में1, 5-मिथाइलसाइटोसिन (एम5सी) संशोधन की पहचान विभिन्न प्रकार के आरएनए में की गई है, जिसमें राइबोसोमल आरएनए, ट्रांसफर आरएनए, मैसेंजर आरएनए, माइक्रो आरएनए, लॉन्ग नॉन-कोडिंग आरएनए, वॉल्ट आरएनए, एन्हांसर आरएनए और छोटे कैजल बॉडी-विशिष्ट आरएनए2 शामिल हैं। आरएनए एम 5 सी विभिन्न जैविक और पैथोलॉजिकल तंत्र से जुड़ा हुआ है जैसे कि पौधे की जड़ के विकासको विनियमित करना 3, वायरल जीन अभिव्यक्ति4, और कैंसरकी प्रगति5। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विभिन्न विकास चरणों में या रोग सेटिंग में जैविक नमूनों के ट्रांसक्रिपटम-वाइड एमआरएनए एम5सी संशोधन प्रोफ़ाइल को चिह्नित करने के लिए सुव्यवस्थित पाइपलाइन प्रदान करना है। बेस-पेयर रिज़ॉल्यूशन 6,7,8,9 पर बिसल्फाइट-परिवर्तित आरएनए में स्थितियों और मात्रात्मक साइटोसिन मिथाइलेशन स्तरों को चिह्नित करने के लिए ट्रांसक्रिपटम-वाइड बिसल्फाइट-अनुक्रमण विकसित किया गया था। यह जीन अभिव्यक्ति और आरएनए भाग्य के साथ एम5सी के संबंध का अध्ययन करते समय विशेष रूप से उपयोगी है जो कोशिकाओं में जैविक नियामक तंत्र में शामिल है। स्तनधारी कोशिका में, दो ज्ञात एम 5 सी पाठक हैं: एएलवाईआरईएफ नाभिक में एम 5 सी को पहचान सकता है और एमआरएनए न्यूक्लियस-टू-साइटोसोल ट्रांसपोर्टर10 के रूप में कार्य करता है, जबकि वाईबीएक्स 1 साइटोप्लाज्म में एम5सी को पहचानसकता है और एमआरएनए स्थिरीकरण11 को बढ़ा सकता है। प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस सीडी 4 + टी कोशिकाओं12 में प्रतिरक्षा मार्गों से संबंधित असामान्य एम5सी एमआरएनए की सूचना दी गई थी। अध्ययनों से एमआरएनएएम 5सी संशोधन और कैंसर प्रतिरक्षा के मॉड्यूलेशन और कैंसर की प्रगति13,14 के बीच एक संबंध का पता चला है। इसलिए, एमआरएनए पर एम5सी संशोधन प्रोफ़ाइल का मानचित्रण संभावित नियामक मशीनरी को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है।
कुछ जैविक परिस्थितियों के तहत आरएनए एम 5सी संशोधन की कार्यात्मक भूमिकाओं की जांच करने के लिए, बाइसल्फाइट रूपांतरण-आधारित (बीएसआरएनए-सेक) और एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन-आधारित दृष्टिकोण जैसे कि एम 5 सी-आरआईपी-सेक, एमआईसीएलआईपी-सेक और 5-एज़ा-सेक को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण मंच के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि ट्रांसक्रिपटम-वाइड स्केल15 पर एम5सी संशोधनों के साथ लक्षित क्षेत्रों और अनुक्रमों का कुशल पता लगाया जा सके। 16. इस प्रोटोकॉल का लाभ एकल-आधार रिज़ॉल्यूशन पर व्यापकआरएनए एम 5 सी परिदृश्य प्रदान करता है क्योंकि एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन-आधारित दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है और एम5सी मिथाइलेशन लैंडस्केप17 के एकल-टुकड़े रिज़ॉल्यूशन को प्राप्त कर सकता है।
सभी आरएनए नमूनों को ओलिगो (डीटी) मोतियों का उपयोग करके एमआरएनए संवर्धन के दो दौरों, बिसल्फाइट प्रतिक्रिया के तीन चक्रों और अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के साथ संसाधित किया जाएगा। आरएनए गुणवत्ता की निगरानी के लिए, प्रत्येक आरएनए नमूने की जांच टुकड़े वितरण का आकलन करने के लिए एमआरएनए शुद्धिकरण और बाइसल्फाइट प्रतिक्रिया की प्रक्रियाओं से पहले और बाद में केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की जाएगी। शुद्ध पुस्तकालयों की जांच उनके पीसीआर एम्प्लिकॉन गुणों, केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डीएनए आकार वितरण टुकड़े, और अनुक्रमण से पहले प्रतिदीप्ति रंजक-आधारित मात्रात्मक परख द्वारा उनकी समग्र मात्रा की जांच की जाएगी। प्रणाली का उपयोग जैविक नमूनों के व्यापक स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है जैसे कि कृषि उपज, पृथक वायरियन, सेल लाइनें, मॉडल जीव और पैथोलॉजिकल नमूने।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, मानकीकृत घटकों का उपयोग करके पॉली (ए) संवर्धन, बाइसल्फाइट रूपांतरण और पुस्तकालय तैयारी की एक विस्तृत पाइपलाइन हासिल की गई थी। आगे के अनुक्रमण विश्लेषण ने रुचि के नमूनों में एमआरएनए 5-म…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ताइवान के राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद द्वारा समर्थित किया गया था। [एनएसटीसी 111-2314-बी-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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