Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación
Summary
Este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil de seguir para llevar a cabo la purificación del ARN poli(A), la conversión de bisulfito y la preparación de bibliotecas utilizando equipos estandarizados para una muestra biológica de interés.
Abstract
Las modificaciones postranscripcionales del ARN en varios tipos de transcripciones de ARN se asocian con una regulación diversa del ARN en las células eucariotas. Se ha demostrado que las modificaciones aberrantes del ARN 5-metilcitosina y la expresión desregulada de las metiltransferasas de ARN están asociadas con diversas enfermedades, incluidos los cánceres. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a la resolución de pares de bases. En este documento, este protocolo presenta los procedimientos de dos rondas de purificación de ARN poli(A), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca en detalle para permitir el mapeo de todo el transcriptoma de los sitios de modificación del ARNm 5-metilcitosina. La evaluación de la cantidad y calidad del ARN después de la reacción principal es esencial para controlar la integridad del ARN y es un paso crítico para garantizar bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Lo ideal es que los procedimientos se puedan completar en tres días. Con este protocolo, el uso de ARN total de alta calidad como entrada puede crear bibliotecas robustas de bisulfito-ARNm para la secuenciación de próxima generación a partir de la muestra de interés.
Introduction
Entre los más de 150 tipos de modificaciones postranscripcionales1, se ha identificado la modificación de la 5-metilcitosina (m5C) en varios tipos de ARN, incluidos el ARN ribosómico, el ARN de transferencia, el ARN mensajero, el micro ARN, el ARN largo no codificante, el ARN de bóveda, el ARN potenciador y los ARN pequeños específicos del cuerpocajal 2. El ARN m 5 C se asocia con diversos mecanismos biológicos y patológicos, como la regulación del desarrollo radicular de las plantas3, la expresión génica viral4 y la progresión del cáncer5. El objetivo de este protocolo es proporcionar canales optimizados para caracterizar el perfil de modificación de ARNm m5C de todo el transcriptoma de muestras biológicas en diferentes etapas de desarrollo o en el entorno de la enfermedad. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a una resolución de pares de bases 6,7,8,9. Esto es particularmente útil cuando se estudia la asociación de m5C con la expresión génica y el destino del ARN que está involucrado en los mecanismos de regulación biológica en las células. En la célula de mamífero, hay dos lectores de m 5 C conocidos: ALYREF puede reconocer m 5 C en el núcleo y sirve como transportador de núcleo de ARNm a citosol10, mientras que YBX1 puede reconocer m5C en elcitoplasma y aumentar la estabilización del ARNm11. Se reportaron ARNm aberrantes m5C relacionados con vías inmunes en células T CD4+ de lupus eritematoso sistémico12. Los estudios han revelado una asociación entre la modificación del ARNmm 5C y la modulación de la inmunidad contra el cáncer y la progresión del cáncer13,14. Por lo tanto, el mapeo del perfil de modificación de m5C en el ARNm puede proporcionar información crucial para dilucidar la posible maquinaria reguladora.
Para investigar las funciones funcionales de la modificación delARN m 5 C en determinadas condiciones biológicas, los enfoques basados en la conversión de bisulfito (bsRNA-seq) y basados en el enriquecimiento de la afinidad de anticuerpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq y 5-Aza-seq, pueden combinarse con la plataforma de secuenciación de alto rendimiento para proporcionar una detección eficiente de regiones y secuencias diana con las modificaciones m5C a escala de todo el transcriptoma15, 16. La ventaja de este protocolo proporciona el panorama completo de ARN m 5 C con una resolución de una sola base, ya que el enfoque basado en el enriquecimiento de afinidad de anticuerpos se basa en la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad y podría lograr la resolución de unsolo fragmento del panorama de metilación de m5C17.
Todas las muestras de ARN se procesarán con dos rondas de enriquecimiento de ARNm utilizando perlas de oligo(dT), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca de secuenciación. Para controlar la calidad del ARN, cada muestra de ARN se examinará mediante electroforesis en gel capilar antes y después de los procedimientos de purificación del ARNm y reacción de bisulfito para evaluar la distribución de los fragmentos. Las bibliotecas purificadas se examinarán por sus cualidades de amplicón de PCR, fragmentos de distribución de tamaño de ADN mediante electroforesis en gel capilar y sus cantidades totales se examinarán mediante ensayos cuantitativos basados en colorantes de fluorescencia antes de la secuenciación. El sistema también se puede utilizar para analizar un amplio espectro de muestras biológicas, como productos agrícolas, viriones aislados, líneas celulares, organismos modelo y especímenes patológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se logró una línea detallada de enriquecimiento de poli(A), conversión de bisulfito y preparación de bibliotecas mediante la utilización de componentes estandarizados. Un análisis de secuenciación adicional proporcionó la identificación de ARNm 5-metilcitosina en muestras de interés.
El paso crítico es la calidad del material de partida (ARN total), ya que la degradación del ARN afectaría la tasa de recuperación de la purificación del ARN poli(A). La muestra d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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