Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

Summary

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho fácil de seguir para conduzir a purificação de RNA poli(A), conversão de bissulfito e preparação de biblioteca usando equipamentos padronizados para uma amostra biológica de interesse.

Abstract

Modificações pós-transcricionais de RNA em vários tipos de transcritos de RNA estão associadas à regulação de diversos RNA em células eucarióticas. Modificações aberrantes do RNA 5-metilcitosina e a expressão desregulada de RNA metiltransferases têm se mostrado associadas a várias doenças, incluindo cânceres. O sequenciamento de bissulfito transdescritor largo foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases. Este protocolo apresenta os procedimentos de duas rodadas de purificação de RNA poli(A), três ciclos de reação de bissulfito e preparação de biblioteca em detalhes para permitir o mapeamento em todo o transcriptoma dos sítios de modificação do RNAm 5-metilcitosina. A avaliação da quantidade e qualidade do RNA após a reação principal é essencial para monitorar a integridade do RNA e é um passo crítico para garantir bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade. O ideal é que os procedimentos possam ser concluídos em até três dias. Com este protocolo, o uso de RNA total de alta qualidade como entrada pode praticamente construir bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração a partir da amostra de interesse.

Introduction

Entre mais de 150 tipos de modificações pós-transcricionais¹, a modificação da 5-metilcitosina (m⁵C) foi identificada em vários tipos de RNAs, incluindo RNA ribossomal, RNA de transferência, RNA mensageiro, micro RNA, RNA longo não codificante, RNA de abóbada, RNA intensificador e RNAs específicos do corpo cajal^{pequeno 2}. O RNA m 5 C está associado a diversos mecanismos biológicos e patológicos, tais como regulação do desenvolvimento radicular de plantas³, expressão gênica viral⁴ e progressão do câncer⁵. O objetivo deste protocolo é fornecer pipelines simplificados para caracterizar o perfil de modificação do mRNA m⁵C do transcriptoma de amostras biológicas em diferentes estágios de desenvolvimento ou no cenário da doença. O sequenciamento transcriptoma-amplo de bissulfito foi desenvolvido para caracterizar as posições e os níveis quantitativos de metilação da citosina no RNA convertido em bissulfito na resolução do par de bases 6,7,8,9. Isto é particularmente útil quando se estuda a associação de m⁵C com a expressão gênica e o destino do RNA que está envolvido nos mecanismos biológicos regulatórios em células. Na célula de mamíferos, existem dois leitores m 5 C conhecidos: ALYREF pode reconhecer m 5 C no núcleo e serve como um transportador de núcleo de RNAm para citosol¹⁰, enquanto YBX1 pode reconhecer m⁵C no citoplasma e aumentar a estabilização de RNAm¹¹. Foram relatados mRNAs^{5 C}aberrantes relacionados a vias imunes em células T CD4+ do lúpus eritematoso sistêmico¹². Estudos têm revelado associação entre modificação do RNAm^{m 5}C e modulação da imunidade do câncer e progressão do câncer^13,14. Assim, o mapeamento do perfil de^{modificação do}m5 C no RNAm pode fornecer informações cruciais para elucidar o potencial maquinário regulatório.

Para investigar os papéis funcionais da modificação do RNAm 5 C sob certas condições biológicas, as abordagens baseadas na conversão de bissulfito (bsRNA-seq) e no enriquecimento por afinidade de anticorpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq e 5-Aza-seq, podem ser combinadas com a plataforma de sequenciamento de alto rendimento para fornecer detecção eficiente de regiões e sequências alvo com as modificações de m⁵C em uma escala de transcriptoma^{15, 16º}. A vantagem deste protocolo fornece a paisagem abrangente do RNA m 5 C em uma resolução de base única, uma vez que a abordagem baseada no enriquecimento por afinidade de anticorpos depende da disponibilidade de anticorpos de alta qualidade e poderia alcançar a resolução de fragmentoúnico da paisagem de metilação de m⁵C¹⁷.

Todas as amostras de RNA serão processadas com duas rodadas de enriquecimento de RNAm usando esferas de oligo(dT), três ciclos de reação de bissulfito e a preparação da biblioteca de sequenciamento. Para monitorar a qualidade do RNA, cada amostra de RNA será examinada por eletroforese em gel capilar antes e após os procedimentos de purificação do RNAm e reação de bissulfito para avaliar a distribuição dos fragmentos. As bibliotecas purificadas serão examinadas por suas qualidades de amplificação de PCR, fragmentos de distribuição de tamanho de DNA por eletroforese em gel capilar e suas quantidades totais examinadas por ensaios quantitativos baseados em corantes de fluorescência antes do sequenciamento. O sistema também pode ser usado para analisar um amplo espectro de amostras biológicas, como produtos agrícolas, vírions isolados, linhagens celulares, organismos modelo e espécimes patológicos.

Protocol

1. Purificação do RNA poli(A) NOTA: Use o RNA total tratado com DNase I e examine a qualidade e integridade do RNA total por eletroforese capilar ou gel convencional antes de proceder à purificação do RNA poli(A). Os investigadores devem ser capazes de identificar as bandas ribossomais 28S e 18S rRNA no campo de alto peso molecular e a banda 5.8S rRNA no campo de baixo peso molecular sem bandas de esfregaço significativas no eletroferograma. As etapas de purificação segu…

Representative Results

Uma série de bibliotecas bsRNA-seq de linhagens celulares19 foi gerada seguindo os procedimentos deste relatório (Figura 1). Após purificação total do RNA acompanhada do tratamento com DNase realizado em amostras de linhagem celular e a qualidade verificada por eletroforese em gel e espectrofotometria UV-Vis (A260/A280), a amostra de RNA pode prosseguir para o enriquecimento de RNA poli(A). Para determinar se a purificação dupla poderia remover…

Discussion

Neste protocolo, um pipeline detalhado de enriquecimento de poli(A), conversão de bissulfito e preparação de bibliotecas foi obtido utilizando componentes padronizados. Análises posteriores de sequenciamento forneceram a identificação do RNAm 5-metilcitosina nas amostras de interesse.

A etapa crítica é a qualidade do material de partida – RNA total – uma vez que a degradação do RNA impactaria a taxa de recuperação da purificação do RNA poli(A). A amostra deve ser cuidadosamente m…

Materials

Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 – magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 – magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection