Обогащение мРНК и бисульфит-мРНК Подготовка библиотек для секвенирования нового поколения
Summary
Этот протокол обеспечивает простой рабочий процесс для проведения очистки поли(А)-РНК, бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки с использованием стандартизированного оборудования для получения интересующего биологического образца.
Abstract
Посттранскрипционные модификации РНК в различных типах транскриптов РНК связаны с разнообразной регуляцией РНК в эукариотических клетках. Было показано, что аберрантные модификации РНК-5-метилцитозина и нерегулируемая экспрессия РНК-метилтрансфераз связаны с различными заболеваниями, включая рак. Для характеристики положения и количественных уровней метилирования цитозина в бисульфит-превращенной РНК при разрешении пары оснований было разработано полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование. В настоящем протоколе подробно описаны процедуры двух раундов очистки поли(А) РНК, трех циклов бисульфитной реакции и подготовки библиотеки, позволяющие проводить транскриптомное картирование сайтов модификации мРНК 5-метилцитозина. Оценка количества и качества РНК после основной реакции имеет важное значение для контроля целостности РНК и является критически важным шагом для обеспечения высококачественных библиотек секвенирования. В идеале процедуры можно завершить в течение трех дней. С помощью этого протокола, используя высококачественную общую РНК в качестве входных данных, можно практически создать надежные библиотеки бисульфит-мРНК для секвенирования следующего поколения из интересующего образца.
Introduction
Среди более чем 150 типов посттранскрипционных модификаций1 модификация 5-метилцитозина (м5С) была идентифицирована в различных типах РНК, включая рибосомную РНК, транспортную РНК, матричную РНК, микроРНК, длинную некодирующую РНК, опорную РНК, энхансерную РНК и малые кажальные тельцеспецифичные РНК2. РНК m 5 C связана с различными биологическими и патологическими механизмами, такими как регуляция развития корней растений3, экспрессия вирусных генов4 и прогрессирование рака5. Целью данного протокола является предоставление оптимизированных конвейеров для характеристики профиля модификации мРНК m5Cна уровне транскриптома биологических образцов на разных стадиях развития или в условиях заболевания. Для характеристики положения и количественных уровней метилирования цитозина в бисульфит-превращенной РНК при разрешении пар оснований 6,7,8,9 было разработано полнотранскриптомное бисульфитное секвенирование. Это особенно полезно при изучении связи m5C с экспрессией генов и судьбой РНК, участвующей в биологических регуляторных механизмах в клетках. В клетке млекопитающих известно два считывателя m 5 C: ALYREF может распознавать m 5 C в ядре и служит транспортером мРНК от ядра к цитозоль10, в то время как YBX1 может распознавать m5C в цитоплазме иувеличивать стабилизацию мРНК11. Аберрантные мРНК m5C, связанные с иммунными путями, были зарегистрированы в CD4+ Т-клетках системной красной волчанки12. Исследования выявили связь между модификацией мРНК m5C и модуляцией ракового иммунитета и прогрессированием рака13,14. Таким образом, картирование профиля модификации m5Cна мРНК может предоставить важную информацию для выяснения потенциального регуляторного механизма.
Для исследования функциональной роли модификации РНК m 5 Cв определенных биологических условиях подходы, основанные на бисульфитной конверсии (bsRNA-seq) и обогащении на основе сродства антител, такие как m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq и 5-Aza-seq, могут быть объединены с высокопроизводительной платформой секвенирования для обеспечения эффективного обнаружения целевых областей и последовательностей с модификациями m5Cпо транскриптомной шкале15. 16. См. Преимущество этого протокола заключается в том, что РНК m5C имеет полное разрешение с одним основанием, поскольку подход, основанный на обогащении сродством антител, опирается на наличие высококачественных антител и может достигать однофрагментного разрешенияm5Cметилированияландшафта 17.
Все образцы РНК будут обработаны двумя раундами обогащения мРНК с использованием гранул олиго(dT), тремя циклами бисульфитной реакции и подготовкой библиотеки секвенирования. Для контроля качества РНК каждый образец РНК будет исследован методом электрофореза в капиллярном геле до и после процедур очистки мРНК и бисульфитной реакции для оценки распределения фрагментов. Очищенные библиотеки будут исследованы по качеству ампликонов ПЦР, распределению фрагментов ДНК по размерам с помощью электрофореза в капиллярном геле, а их общее количество будет исследовано количественными методами на основе флуоресцентных красителей перед секвенированием. Система также может быть использована для анализа широкого спектра биологических образцов, таких как сельскохозяйственная продукция, изолированные вирионы, клеточные линии, модельные организмы и патологические образцы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе детальный конвейер обогащения поли(А), бисульфитной конверсии и подготовки библиотеки был достигнут за счет использования стандартизированных компонентов. Дальнейший секвенированный анализ позволил идентифицировать мРНК-5-метилцитозин в интересующих образцах.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным советом по науке и технологиям Тайваня. [НСТК 111-2314-Б-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
- Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
