Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie
Summary
Dit protocol biedt een eenvoudig te volgen workflow voor het uitvoeren van poly(A) RNA-zuivering, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding met behulp van gestandaardiseerde apparatuur voor een biologisch monster van belang.
Abstract
RNA post-transcriptionele modificaties in verschillende soorten RNA-transcripten worden geassocieerd met diverse RNA-regulatie in eukaryote cellen. Afwijkende RNA 5-methylcytosinemodificaties en de ontregelde expressie van RNA-methyltransferasen blijken geassocieerd te zijn met verschillende ziekten, waaronder kanker. Transcriptoombrede bisulfiet-sequencing werd ontwikkeld om de posities en de kwantitatieve cytosinemethylatieniveaus in het bisulfiet-geconverteerde RNA te karakteriseren bij de basenpaarresolutie. Hierin presenteert dit protocol de procedures van twee rondes van poly(A) RNA-zuivering, drie cycli van bisulfietreactie en bibliotheekvoorbereiding in detail om het transcriptoombrede in kaart brengen van mRNA-5-methylcytosinemodificatieplaatsen mogelijk te maken. De beoordeling van de hoeveelheid en kwaliteit van RNA na de hoofdreactie is essentieel om de integriteit van RNA te bewaken en is een cruciale stap om sequencingbibliotheken van hoge kwaliteit te garanderen. Idealiter kunnen de procedures binnen drie dagen worden afgerond. Met dit protocol kan het gebruik van hoogwaardig totaal RNA als input praktisch robuuste bisulfiet-mRNA-bibliotheken opbouwen voor sequencing van de volgende generatie van het monster van belang.
Introduction
Van de meer dan 150 soorten post-transcriptionele modificaties1 is 5-methylcytosine (m5C)-modificatie geïdentificeerd in verschillende soorten RNA’s, waaronder ribosomaal RNA, transfer-RNA, boodschapper-RNA, micro-RNA, lang niet-coderend RNA, kluis-RNA, enhancer-RNA en kleine cajal lichaamsspecifieke RNA’s2. Het RNA m 5 C wordt geassocieerd met diverse biologische en pathologische mechanismen, zoals het reguleren van de ontwikkeling van plantenwortels3, virale genexpressie4 en kankerprogressie5. Het doel van dit protocol is om gestroomlijnde pijplijnen te bieden om het transcriptoombrede mRNA m5C-modificatieprofiel van biologische monsters in verschillende ontwikkelingsstadia of in de ziekteomgeving te karakteriseren. Transcriptoombrede bisulfiet-sequencing werd ontwikkeld om de posities en de kwantitatieve cytosinemethylatieniveaus in het bisulfiet-geconverteerde RNA te karakteriseren bij basenpaarresolutie 6,7,8,9. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van de associatie van m5C met genexpressie en RNA-lot dat betrokken is bij de biologische regulerende mechanismen in cellen. In de zoogdiercel zijn er twee bekende m 5 C-lezers: ALYREF kan m 5 C in de kern herkennen en dient als een mRNA-kern-naar-cytosol-transporter10, terwijl YBX1 m5C in het cytoplasma kan herkennen ende mRNA-stabilisatiekan verhogen 11. Afwijkende m5C-mRNA’s gerelateerd aan immuunroutes werden gerapporteerd in systemische lupus erythematosus CD4+ T-cellen12. Studies hebben een verband aangetoond tussen mRNA m5C-modificatie en modulatie van kankerimmuniteit en kankerprogressie13,14. Daarom kan het in kaart brengen van het m5C-modificatieprofiel op het mRNA cruciale informatie opleveren om de potentiële regulerende machinerie op te helderen.
Om de functionele rol van RNA m 5 C-modificatie onder bepaalde biologische omstandigheden te onderzoeken, kunnen de op bisulfietconversie gebaseerde (bsRNA-seq) en op antilichaamaffiniteitsverrijking gebaseerde benaderingen zoals m5 C-RIP-seq, miCLIP-seq en 5-Aza-seq worden gecombineerd met het high-throughput sequencing-platform om efficiënte detectie van gerichte regio’s en sequenties te bieden met de m5C-modificaties op een transcriptoombredeschaal15, 16. okt. Het voordeel van dit protocol biedt het uitgebreide RNA m 5C-landschap met een resolutie van één basis, aangezien de op verrijking gebaseerde benadering van antilichaamaffiniteit afhankelijk is van de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen en de resolutie van één fragment van m5C-methylatielandschap17 zou kunnen bereiken.
Alle RNA-monsters zullen worden verwerkt met twee rondes van mRNA-verrijking met behulp van oligo(dT)-kralen, drie cycli van bisulfietreactie en de voorbereiding van de sequentiebibliotheek. Om de RNA-kwaliteit te bewaken, zal elk RNA-monster worden onderzocht door middel van capillaire gelelektroforese voor en na de procedures van mRNA-zuivering en bisulfietreactie om de fragmentverdeling te beoordelen. De gezuiverde bibliotheken zullen worden onderzocht op hun PCR-ampliconkwaliteiten, DNA-grootteverdelingsfragmenten door capillaire gelelektroforese en hun totale hoeveelheden onderzocht door kwantitatieve tests op basis van fluorescentiekleurstoffen voordat ze worden gesequenced. Het systeem kan ook worden gebruikt om een breed spectrum van biologische monsters te analyseren, zoals landbouwproducten, geïsoleerde virionen, cellijnen, modelorganismen en pathologische monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol werd een gedetailleerde pijplijn van poly(A)-verrijking, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding bereikt door gebruik te maken van gestandaardiseerde componenten. Verdere sequentieanalyse leverde de identificatie op van mRNA 5-methylcytosine in interessante monsters.
De kritieke stap is de kwaliteit van het uitgangsmateriaal – totaal RNA – aangezien de afbraak van RNA van invloed zou zijn op de herstelsnelheid van poly(A)-RNA-zuivering. Het monster moet zorgvuldig worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie van Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
- Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
