Yeni Nesil Dizileme için mRNA ve Bisülfit-mRNA Kütüphanesinin Zenginleştirilmesi Hazırlığı
Summary
Bu protokol, ilgilenilen biyolojik bir numune için standartlaştırılmış ekipman kullanarak poli(A) RNA saflaştırması, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlığı yapmak için takip edilmesi kolay bir iş akışı sağlar.
Abstract
Çeşitli RNA transkript tiplerindeki RNA transkripsiyon sonrası modifikasyonlar, ökaryotik hücrelerde çeşitli RNA regülasyonu ile ilişkilidir. Anormal RNA 5-metilsitozin modifikasyonlarının ve RNA metiltransferazların düzensiz ekspresyonunun kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Baz çifti çözünürlüğünde bisülfit dönüştürülmüş RNA’daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Burada, bu protokol, mRNA 5-metilsitozin modifikasyon bölgelerinin transkriptom çapında haritalanmasına izin vermek için iki tur poli(A) RNA saflaştırması, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve kütüphane hazırlama prosedürlerini ayrıntılı olarak sunar. Ana reaksiyondan sonra RNA miktarının ve kalitesinin değerlendirilmesi, RNA bütünlüğünü izlemek için gereklidir ve yüksek kaliteli dizileme kitaplıkları sağlamak için kritik bir adımdır. İdeal olarak, prosedürler üç gün içinde tamamlanabilir. Bu protokolle, girdi olarak yüksek kaliteli toplam RNA’nın kullanılması, ilgilenilen örnekten yeni nesil dizileme için pratik olarak sağlam bisülfit-mRNA kitaplıkları oluşturabilir.
Introduction
150’den fazla transkripsiyon sonrası modifikasyontürü arasında 1, 5-metilsitozin (m5C) modifikasyonu, ribozomal RNA, transfer RNA, haberci RNA, mikro RNA, uzun kodlamayan RNA, tonoz RNA, güçlendirici RNA ve küçük cajal vücuda özgü RNA’lar2 dahil olmak üzere çeşitli RNA tiplerinde tanımlanmıştır. RNA m5C, bitki kök gelişimini3, viral gen ekspresyonu4 ve kanser ilerlemesini5 düzenleme gibi çeşitli biyolojik ve patolojik mekanizmalarla ilişkilidir. Bu protokolün amacı, farklı gelişim aşamalarında veya hastalık ortamında biyolojik örneklerin transkriptom çapında mRNA m5C modifikasyon profilini karakterize etmek için aerodinamik boru hatları sağlamaktır. Baz çifti çözünürlüğü 6,7,8,9’da bisülfit dönüştürülmüş RNA’daki pozisyonları ve kantitatif sitozin metilasyon seviyelerini karakterize etmek için transkriptom çapında bisülfit dizileme geliştirilmiştir. Bu, özelliklem5C’nin hücrelerdeki biyolojik düzenleyici mekanizmalarda yer alan gen ekspresyonu ve RNA kaderi ile ilişkisini incelerken yararlıdır. Memeli hücresinde bilinen iki m5 C okuyucusu vardır: ALYREF, çekirdektem5C’yitanıyabilir ve bir mRNA çekirdeğinden sitozole taşıyıcısı 10 olarak hizmet ederken, YBX1 sitoplazmadam5C’yi tanıyabilir ve mRNA stabilizasyonunu artırabilir11. Sistemik Lupus Eritematozus CD4+ T hücrelerinde immün yolaklarla ilgili anormal m5C mRNA’ları bildirilmiştir12. Çalışmalar, mRNA m5C modifikasyonu ve kanser bağışıklığının modülasyonu ile kanser ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur13,14. Bu nedenle, mRNA üzerindeki m5C modifikasyon profilinin haritalanması, potansiyel düzenleyici mekanizmayı aydınlatmak için çok önemli bilgiler sağlayabilir.
Belirli biyolojik koşullar altında RNA m 5 C modifikasyonununfonksiyonel rollerini araştırmak için, m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ve 5-Aza-seq gibi bisülfit dönüşüm tabanlı (bsRNA-seq) ve antikor afinite zenginleştirme tabanlı yaklaşımlar, transkriptom çapında bir ölçekte m5C modifikasyonları ile hedeflenen bölgelerin ve dizilerin verimli bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için yüksek verimli dizileme platformu ile birleştirilebilir15, 16. Bu protokolün avantajı, antikor afinitesi zenginleştirmeye dayalı yaklaşım, yüksek kaliteli antikorların mevcudiyetine dayandığından vem5C metilasyon manzarası17’nin tek parça çözünürlüğünü elde edebildiğinden, tek bazlı bir çözünürlükte kapsamlı RNA m5C manzarasını sağlar.
Tüm RNA örnekleri, oligo(dT) boncukları, üç döngü bisülfit reaksiyonu ve dizileme kütüphanesi hazırlığı kullanılarak iki tur mRNA zenginleştirme ile işlenecektir. RNA kalitesini izlemek için, her RNA numunesi, fragman dağılımını değerlendirmek için mRNA saflaştırma ve bisülfit reaksiyonu prosedürlerinden önce ve sonra kılcal jel elektroforezi ile incelenecektir. Saflaştırılmış kütüphaneler, PCR amplikon nitelikleri, kılcal jel elektroforezi ile DNA boyutu dağılım fragmanları ve dizilemeden önce floresan boya bazlı kantitatif tahlillerle incelenen toplam miktarları ile incelenecektir. Sistem ayrıca tarımsal ürünler, izole viryonlar, hücre hatları, model organizmalar ve patolojik örnekler gibi geniş bir biyolojik numune yelpazesini analiz etmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, standartlaştırılmış bileşenler kullanılarak ayrıntılı bir poli(A) zenginleştirme, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlama hattı elde edildi. Daha ileri dizileme analizi, ilgilenilen örneklerde mRNA 5-metilsitozinin tanımlanmasını sağladı.
Kritik adım, başlangıç materyalinin kalitesidir – toplam RNA – çünkü RNA’nın bozunması poli (A) RNA saflaştırmasının geri kazanım oranını etkileyecektir. Poli(A) RNA saflaştırma adımını gerçekle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi tarafından desteklenmiştir. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
- Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
