Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing
Summary
Dieses Protokoll bietet einen einfach zu befolgenden Arbeitsablauf für die Durchführung von Poly(A)-RNA-Aufreinigung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung mit standardisierten Geräten für eine biologische Probe von Interesse.
Abstract
RNA-posttranskriptionelle Modifikationen in verschiedenen Arten von RNA-Transkripten sind mit einer vielfältigen RNA-Regulation in eukaryotischen Zellen verbunden. Es wurde gezeigt, dass aberrante RNA-5-Methylcytosin-Modifikationen und die dysregulierte Expression von RNA-Methyltransferasen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht werden. Die Transkriptom-weite Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um die Positionen und die quantitativen Cytosin-Methylierungsniveaus in der Bisulfit-konvertierten RNA mit Basenpaarauflösung zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden die Verfahren von zwei Runden der Poly(A)-RNA-Reinigung, drei Zyklen der Bisulfitreaktion und der Bibliotheksvorbereitung im Detail vorgestellt, um die transkriptomweite Kartierung von mRNA-5-Methylcytosin-Modifikationsstellen zu ermöglichen. Die Bewertung der RNA-Quantität und -Qualität nach der Hauptreaktion ist für die Überwachung der RNA-Integrität unerlässlich und ein entscheidender Schritt zur Gewährleistung qualitativ hochwertiger Sequenzierungsbibliotheken. Im Idealfall können die Eingriffe innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden. Mit diesem Protokoll können durch die Verwendung hochwertiger Gesamt-RNA als Input praktisch robuste Bisulfit-mRNA-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation aus der interessierenden Probe aufgebaut werden.
Introduction
Unter über 150 Arten von posttranskriptionellen Modifikationen1 wurde eine Modifikation von 5-Methylcytosin (m5C) in verschiedenen Arten von RNAs identifiziert, darunter ribosomale RNA, Transfer-RNA, Boten-RNA, Mikro-RNA, lange nicht-kodierende RNA, Vault-RNA, Enhancer-RNA und kleine Cajal-Körper-spezifische RNAs2. Die RNA m5Cist mit verschiedenen biologischen und pathologischen Mechanismen assoziiert, wie z. B. der Regulierung der Pflanzenwurzelentwicklung3, der viralen Genexpression4 und der Krebsprogression5. Das Ziel dieses Protokolls ist es, optimierte Pipelines zur Charakterisierung des transkriptomweiten mRNA-m5C-Modifikationsprofils biologischer Proben in verschiedenen Entwicklungsstadien oder im Krankheitsstadium bereitzustellen. Die Transkriptom-weite Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um die Positionen und die quantitativen Cytosin-Methylierungsniveaus in der Bisulfit-umgewandelten RNA mit einer Basenpaar-Auflösungvon 6,7,8,9 zu charakterisieren. Dies ist besonders nützlich, wenn es darum geht, die Assoziation von m5C mit der Genexpression und dem RNA-Schicksal zu untersuchen, die an den biologischen Regulationsmechanismen in Zellen beteiligt sind. In der Säugetierzelle gibt es zwei bekanntem5C-Reader: ALYREF kann m 5C am Zellkern erkennen und dient als mRNA-Nucleus-to-Cytosol-Transporter10, während YBX1 m5Cim Zytoplasma erkennen unddie mRNA-Stabilisierung11 erhöhen kann. Aberrante m5-C-mRNAs, die mit Immunsignalwegen in Verbindung stehen, wurden in systemischen Lupus erythematodes CD4+ T-Zellen berichtet12. Studien haben einen Zusammenhang zwischen der mRNA-m5C-Modifikation und der Modulation der Krebsimmunität und dem Fortschreiten der Krebserkrankung gezeigt13,14. Daher kann die Kartierung desm5C-Modifikationsprofils auf der mRNA entscheidende Informationen zur Aufklärung der potenziellen regulatorischen Maschinerie liefern.
Um die funktionelle Rolle der RNA-m5C-Modifikation unter bestimmten biologischen Bedingungen zu untersuchen, können die auf Bisulfitumwandlung (bsRNA-seq) und Antikörperaffinitätsanreicherung basierenden Ansätze wie m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq und 5-Aza-seq mit der Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform kombiniert werden, um eine effiziente Detektion von Zielregionen und -sequenzen mit den m5C-Modifikationen auf einer transkriptomweiten Skala zu ermöglichen15, 16. Anmelden Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die umfassende RNA-m5C-Landschaft mit einer Einzelbasenauflösung versehen ist, da der auf Antikörperaffinität basierende Ansatz auf der Verfügbarkeit hochwertiger Antikörper beruht und die Einzelfragmentauflösung derm5C-Methylierungslandschaft17 erreichen könnte.
Alle RNA-Proben werden mit zwei Runden der mRNA-Anreicherung mit Oligo(dT)-Kügelchen, drei Zyklen der Bisulfitreaktion und der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek verarbeitet. Um die RNA-Qualität zu überwachen, wird jede RNA-Probe vor und nach den Verfahren der mRNA-Reinigung und der Bisulfitreaktion mittels Kapillargelelektrophorese untersucht, um die Fragmentverteilung zu beurteilen. Die gereinigten Bibliotheken werden vor der Sequenzierung auf ihre PCR-Amplikonqualitäten, DNA-Größenverteilungsfragmente durch Kapillargelelektrophorese und ihre Gesamtmengen durch Fluoreszenzfarbstoff-basierte quantitative Assays untersucht. Das System kann auch zur Analyse eines breiten Spektrums biologischer Proben wie landwirtschaftlichen Erzeugnissen, isolierten Virionen, Zelllinien, Modellorganismen und pathologischen Proben verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wurde eine detaillierte Pipeline von Poly(A)-Anreicherung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung durch die Verwendung standardisierter Komponenten erreicht. Weitere Sequenzierungsanalysen ermöglichten die Identifizierung von mRNA 5-Methylcytosin in Proben von Interesse.
Der entscheidende Schritt ist die Qualität des Ausgangsmaterials – der Gesamt-RNA -, da der Abbau von RNA die Wiederfindungsrate der Poly(A)-RNA-Reinigung beeinträchtigen würde. Die Probe sollte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Science and Technology Council of Taiwan unterstützt. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
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